一、酶制剂及其底物 凡无毒性又能呈现有色化学反应的酶,原则上均可作为标记用。但作为标记抗体用的酶应满足下列要求 1. 来源方便,易于纯化; 2. 比活性高,性质稳定; 3. 酶活性和量能用简单方法测定。 目前在免疫酶技术中常用的酶为辣根过氧化物酶(HRP)和硷性磷酸酶(AP),其次还有葡萄糖氧化酶,β-半乳糖苷酶、溶菌酶和苹果酸脱氢酶等。
由于辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase,
HRP)比活性高,稳定,分子量小,纯酶容易制备,所以最常用。HRP广泛分布于植物界,辣根中含量高,它是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋白,糖含量18
%。HRP由多个同功酶组成,分子量为40000,等电点为PH3~9,酶催化的最适PH因供氢体不同而稍有差异,但多在PH5左右。酶溶于水和58
%以下饱和度硫酸铵溶液。HRP的辅基和酶蛋白最大吸收光谱分别为403 nm和275 nm,一般以OD403 nm /OD275
nm的比值RZ(德文Reinheit
Zahl)表示酶的纯度。高纯度的酶RZ值应在3.0左右(最高可达3.4)。RZ值越小,非酶蛋白就越多。值得注意的是,纯度并不表示酶活性,如当酶变性后,RZ值仍可不变。 HRP的催化反应需要底物过氧化氢(H2O2)和供氢体(DH2)。供氢体多为无色的还原型染料,通过反应可生成有色的氧化型染料(D)。酶促反应的过程如下 HRP DH2+H2O2────→D+2H2O
供氢体的种类很多,形成的产物特点不一。如DAB(3,3-二氨基联苯胺)的反应产物为不溶性沉淀物,并有电子密度,故适宜于做免疫酶染色或电镜观察。5AS(5-氨基水杨酸)早期曾用于ELISA,但其溶解度不够大,且空白孔不易控制到无色,现已很少应用。OT(邻联甲苯胺)的特点是能产生鲜艳的蓝绿色产物且灵敏度较高,但反应中受温度影响较大,而且由于产物不稳定,需要在短时间内进行测定。目前用得较广泛和较满意的供氢体是:OPD(邻苯二胺)和TMB(四甲基联苯胺)。前者形成的产物为深桔黄色或棕色,后者产物为蓝绿色,二者的可溶性均好,在避光处颜色稳定,空白可近于无色,灵敏度上据报道后者比前者可高4倍以上。另外,还有一种供氢体称ABTS[2,2'-边氮基-双(3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺酸)],其反应产物呈蓝绿色,且灵敏度和稳定性均好。尤其是在致癌的潜在可能性方面,ABTS与TMB皆是值得被优选的供氢体。 由于HRP的底物H2O2本身又是酶的抑制剂,因此酶促反应中使用的H2O2不能过量。应控制在经较短时间反应后呈色即达高峰(说明H2O2已消耗殆尽)。这样即使再延长时间也不会增加反应产物的颜色。 二、HRP标记抗体的方法 酶与抗体交联的方法有许多种,根据酶的结构不同可采用不同的方法。对于制备HRP结合物,可用戊二醛二步法和过碘酸钠法。尤以简易过碘酸钠法更为常用。 1. 戊二醛二步法 (1)原理 戊二醛为一种双功能试剂,通过其醛基分别与酶和免疫球蛋白上的氨基共价结合,形成酶-戊二醛-免疫球蛋白结合物。 (2)标记步骤 ①称取HRP25 mg溶于1.25 %戊二醛溶液中,于室温静置过夜。 ②反应后的酶溶液经Sephadex G-25层析柱,用生理盐水洗脱。流速控制在1 ml/1 分钟,收集棕色流出液。如体积大于5 ml,则以PEG浓缩至5 ml。放置25 ml小烧杯中,缓慢搅拌。 ③将待标记的抗体12.5 mg用生理盐水稀释至5 ml,搅拌下逐滴加入酶溶液中。 ④用1 M PH9.5碳酸缓冲液0.25 ml,继续搅拌3 小时。 ⑤加0.2 M赖氨酸0.25 ml,混匀后,置室温2 小时。 ⑥在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵,置4 ℃1 小时。 ⑦3000 rpm离心半小时,弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次,最后沉淀物溶于少量0.15 M PH7.4的PBS中。 ⑧将上述溶液装入透析袋中,对0.15 M PH7.4的PB缓冲盐水透析,去除铵离子后(用萘氏试剂检测),10000 rpm离心30 分钟去除沉淀,上清液即为酶结合物,分装后,冰冻保存。 (3)结果判定 ①定性及效价滴定 用特异性抗原(或抗体)同酶标记抗体(或抗免疫球蛋白抗体)作双向琼脂扩散试验或免疫电泳试验。然后用酶的底物使沉淀弧显色,可初步鉴定其活性。最后以直接ELISA法(或在正式实验系统里)对酶结合物进行滴定。 ②定量和克分子比值测定:可用分光光度计测定(光程1 cm)。 酶量(mg/ml)=OD403 nm×0.4 IgG量(mg/ml)=OD280 nm-OD403 nm×0.42×0.94×0.62 酶量(mg/ml) IgG量(mg/ml) 酶量 克分子比值=──────── ÷ ─────── = ─── × 4 40000 160000 IgG量 ③本法标记步骤比较简单,重复性好。缺点是酶的利用率低,一般只有2~4 %的酶与蛋白质结合。 2. 简易过碘酸钠法 本法是以NaIO4先将HRP表面的糖分子氧化成醛基,然后再与Ig上的氨基相结合,所获酶标记抗体的产率高,将近70 %的HRP和Ig结合,99 %的Ig与酶结合,酶与Ig的活性无重大损失,是目前最常用的方法。 (1)原理 经典的过碘酸钠法中需采用二硝基氟苯封闭HRP上残留的α-和ε氨基基以避免酶分子之间的交联。后来Wilson等改用在低PH下使NaIO4氧化HRP,从而省去了二硝基氟苯封闭HRP步骤。HRP经NaIO4氧化后形成的醛化酶可与抗体分子的氨基相连,形成斯夫氏硷,后者可进一步用NaBH4(或乙醇胺)还原生成稳定的酶标记抗体。 (2)标记步骤 ①称取5 mgHRP溶解于1 ml蒸馏水中。 ②于上液中加入0.2 ml新配的0.1 M NaIO4溶液,室温下避光搅拌20 分钟。 ③将上述溶液装入透析袋中,对1 mM PH4.4的醋酸钠缓冲液透析,4 ℃过夜。 ④加20 μl 0.2 M PH9.5碳酸盐缓冲液,使以上醛化桯RP的PH升高到9.0~9.5,然后立即加入10 mg IgG(抗体,或SPA5 mg)在1 ml 0.01 M碳酸盐缓冲液中,室温避光轻轻搅拌2 小时。 ⑤加0.1 ml新配的4 mg/ml NaBH4液,混匀,再置4 ℃ 2 小时。 ⑥将上述液装入透析袋中,对0.15 M PH7.4 PBS透析,4 ℃过夜。 其余步骤(纯化)同戊二醛标记步骤的⑥、⑦、⑧。 (3)结果判定 除标记物IgG量的计算,略有不同以外,其余均同戊二醛法。 IgG量(mg/ml)=(OD280 nm-OD403 nm×0.3)×0.62
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