高效液相色谱法测定醋氯芬酸肠溶胶囊中的有关物质

方案优势

该方法准确、灵敏、重现性好，并能有效地控制醋氯芬酸肠溶胶囊的质量。

采用标准

相关标准

方法/原理/步骤

　　试药

　　醋氯芬酸肠溶胶囊(批号：100777-200401，含量：100%)、双氯芬酸对照品、醋氯酚酸甲酯对照品、醋氯酚酸乙酯对照品、醋氯酚酸苄酯对照品、双氯芬酸甲酯对照品、双氯芬酸乙酯对照品、双氯芬酸苄酯对照品、醋酸醋氯芬乙酸对照品、吲哚醋氯酚酸对照品、醋酸醋氯芬酸对照品(LGC GmbH Im Biotechnologiepark, D-14943 Lucknwalck, Germany)

　　甲醇、乙腈均为色谱纯，水为三次蒸馏水，其余试剂均为分析纯。

　　溶液制备

　　对照品溶液：精密称取各杂质对照品各12.20mg，置于100 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，即得。

　　供试品溶液：精密称取肠溶胶囊适量，用甲醇溶解并稀释成每1mL约含1mg醋氯芬酸的溶液。摇匀，滤过，即得。

　　专属性试验

　　取辅料，按处方配比，制成不含主药醋氯芬酸的空白溶剂，超声取上清液，作为供试品溶液，精密量取20μL注入液相色谱仪，色谱图见图1，实验结果表明，辅料不干扰本品的测定。称取醋氯芬酸肠溶胶囊适量(约40mg)5份，另取等量的空白辅料作为平行对照，分别置于10mL容量瓶中，经光(4500lx，5天)、酸(0.09 mol/L盐酸，5min)、碱(0.05mol/L氢氧化钠，5min)、高温(120℃，5h)、氧化(30%H2O2溶液，4h)5种破坏试验，其中醋氯芬酸肠溶胶囊经强光、高温、强氧化未产生新的杂质，经酸碱破坏杂质A、杂质B、杂质I三种已知杂质含量变大，而空白辅料均未产生破坏杂质，色谱图见图1，结果表明本色谱条件可使醋氯芬酸与其他降解产物达到有效地分离，且与相邻杂质峰的分离度良好，符合要求。

　　线性范围

　　精密量取标准贮备液适量，用甲醇稀释制成系列浓度溶液。分别进样测定，记录色谱图。以各自峰面积A为纵坐标、浓度c为横坐标，进行线性回归，并以信噪比(S/N)=3计算各溶剂的最低检测限，结果可见，各物质在相应的浓度范围内线性关系良好。

　　精密度试验

　　精密量取对照品溶液，连续测定6次，测得各溶剂峰面积的RSD分别为1.5%、1.4%、1.04%、0.23%、0.6%、0.8%、1.3%。

　　回收率试验

　　分别配制低(80%)、中(100%)、高(120%)3种不同浓度的对照品溶液，以对照品溶液作对照。精密称取供试品适量，分别加入上述不同浓度的对照溶液适量，溶解制成0.1 g/ml的溶液，摇匀，共9份。在上述色谱条件下进行测定，得平均回收率(n=3)：杂质A 98.8%、杂质B99.2%、杂质C100.2%、、杂质D99.6%、、杂质E102.3%、杂质F100.7%、杂质G99.1%、杂质H100.9%、杂质I99.5%、醋氯芬酸100.7%、

　　稳定性试验

　　配置标准对照溶液，在上述色谱条件下分别于0h，2h，4h，6h，8h进行测定，记录色谱图，测得各溶剂峰面积的RSD分别为1.1%、1.7%、0.9%、1.2%、0.8%、1.2%、1.5%。

　　醋氯芬酸肠溶胶囊有关物质分析

　　取供试品溶液，在上述色谱条件下进行进样分析，谱图见图2，采用外标法，与标准对照溶液各杂质峰面积进行比较，从而测得样品各杂质含量见下表。

仪器设备

　　仪器

　　LCMS-2010EV高效液相色谱仪(日本岛津公司)；LC-MS solution液相色谱工作站(日本岛津公司)Thermo BDS HYPERSIL C18柱(4.6mm×250mm, 5μm)。

　　色谱条件与系统适用性试验

　　色谱柱: Thermo BDS HYPERSIL C18柱(4.6mm×250mm, 5μm)；流动相A为20mmol/L的磷酸盐缓冲溶液(用12g/L的氢氧化钠溶液调pH=7.00)；流动相B为甲醇-乙腈(1:1)；检测波长为275 nm;柱温为40℃；流速为1.0ml/min；进样量20μL。梯度程序如下

　　表1 梯度洗脱程序

结果与讨论

　　结果

　　表醋氯芬酸胶囊样品测定结果

　　讨论

　　检测波长的选择

　　本实验利用二极管阵列检测器对醋氯芬酸对照品、样品及杂质对照品在全波长范围内进行光谱扫描，发现醋氯芬酸在275nm处有最大吸收，且在此波长处，其他杂质也有较好地吸收，故选择了275nm作为含量测定和有关物质检查的检测波长。

　　流动相A pH的选择

　　本实验考察了不同pH的磷酸盐缓冲液时的色谱效果，结果显示当pH太小时，醋氯芬酸与杂质A重合，这可能是由于醋氯芬酸发生了水解；当pH太大时，峰形变差，最终选择pH=7.0时，主峰与各杂质峰基本达到分离。

　　流动相B的选择

　　本实验考察了甲醇，乙腈，甲醇-乙腈对分离效果的影响，结果显示流动相B单独使用甲醇或乙腈时，主峰与相邻杂质峰的分离度太小，且主峰拖尾严重，选用三元混合体系更有利于调节离子强度，通过考察不同比例的甲醇-乙腈，发现当其比例为1∶1时，保留时间、峰形和分离效果好。梯度程序的选择醋氯芬酸及其9个杂质的结构及性质差别较大，采用等度洗脱模式只能检测到9个色谱峰，杂质B和D重叠，并且检测时间要到90分钟，因此采用提多洗脱模式，既可以实现10各组分的基线分离，并且对于破会后的新杂质也不影响测定，分析时间缩短一倍。醋氯芬酸的结构不稳定，容易降解，并且原料中的副产物较多，该方法非常适合与醋氯芬酸及其制剂中杂质的检查。