流式细胞仪实验方法-2

六、流式检测细胞染色基本过程（以全血为例）

1、   收获细胞：肝素钠抗凝的静脉血，按1：1与培养基混匀，加刺激剂，同时加蛋白转运抑制剂（参照说明书）， 混匀后，37℃，5%二氧化碳培养4-6小时

2、   阻断Fc受体：用于消除非特异性的结合染色

①      在小鼠，可使用纯化的FcII/III受体的抗体（CD16/32），按照1ug/10⁶细胞的用量，在染色缓冲液中4℃孵育15分钟，PBS清洗后，直接进行下一步染色。

②      对于人和大鼠，可直接使用过量的与荧光抗体相同来源和亚型不相关的纯化Ig或者血清进行阻断

3、细胞表面染色

①      加适当的细胞表面染色试剂20L于Falcon管中，加入100L激活后的全血 （细胞浓度维持在2×10⁶/mL） 混匀，室温暗处孵育15分钟；

②      加入溶血素，室温暗处孵育10分钟。（注意：PMA激活的全血可能会溶血不完全。）

③      离心500g 5分钟，弃上清

4、固定和破膜

①      加固定剂，室温暗处孵育15分钟，离心500g 5分钟，弃上清；

②      加破膜剂温暗处孵育10分钟。（剂量参照说明书）

③      加23mLPBS洗液，离心500g 5分钟，弃上清。

5、细胞内染色

①      加入荧光标记的细胞因子抗体，混匀，室温暗处孵育30分钟。

②      加23mL洗液，离心500g 5分钟，弃上清，加入500LPBS上机或加入500L 1% PFA固定后再上机

七、注意事项

1.         标本处理：避免使用络合钙的抗凝剂，如ACD与EDTA，因为它们会限制钙依赖性激活过程，推荐用肝素钠。此外LPS，一种常见的生物试剂污染物，是强细胞激活剂，可能会混淆试验结果。血样在8小时内分析，超过8小时会导致活性的损失，一般细胞因子阳性细胞会减少5%。如不能在8小时之内检测，应将真空采血管水平室温放置。

2.         刺激激活：检测不同的细胞因子根据情况选择不同的刺激剂组合和刺激时间，以保证zui佳的检测效果。比如，要检测IFN-γ则可选择PMA和Ionomycin同时刺激；如果用CD4做表面标记，由于多数病人的CD4抗原会因PMA的激活而有不同程度的下调，所以培养时间不能太长，4-6小时为宜，否则CD4下调影响分析

3.         选择合适的对照：为保证结合的真是和可靠性，至少荧光设置以下对照：

①        未刺激对照：激活时由于BFA的存在抑制了胞内蛋白的转运，因此在激活过程中产生  的抗原与细胞因子会滞留胞内，未刺激对照也应包含BFA。

②        激活对照：激活对照使用细胞表面表达CD69来评价激活与否，如果未达到CD69期望的水平，则激活步骤出了问题，某一试剂可能失活，过期，制备不当或溶剂污染，需制备新鲜刺激剂重新实验。

③        同型对照：使用与荧光标记抗体相同来源、相同标记、相同剂量和亚型的免疫球蛋白，用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表面而产生的背景染色。

4.         Fc受体阻断：使用试剂阻断Fc受体可以有效减少非特异荧光染色，在小鼠可以用纯化的抗小鼠的CD16/32（eBioscience, 目录号14-0161-81），在大鼠可以用纯化的抗大鼠的CD32，在人可以用过量的同种无关纯化Ig或血清。

5.         荧光素的选择：检测相对低表达细胞因子如IL-4时，应选用PE或APC标记；单检测某一细胞因子时zui好也选用PE或APC标记；同时检测多种细胞因子时，弱表达的应选用PE或APC，FITC标记zui好用于高表达细胞因子如IFN-γ

八、问题与解答

Th1/Th2细胞研究方法

尽管目前提出了较多的 Th1/Th2细胞表面标志，但根据淋巴细胞因子谱的异同识别Th1和Th2细胞仍然是目前zui有效的手段，特别是细胞内因子标记的流式细胞技术。近来由于细胞因子ELISA试剂盒的不断涌现，为研究Th1/Th2细胞因子谱的变化提供了准确、可靠、快速的测定方法。但研究CD4+淋巴细胞细胞因子谱变化时需要将T淋巴细胞特异克隆。zui近发现，在外周血白细胞中，除CD4淋巴细胞外，CD8细胞也存在Th1和Th2样细胞因子谱的变化，甚至酸性粒细胞也具有产生多种细胞因子的能力，如酸性粒细胞可分泌IL-4、IL-5、IL-1α、IL-6、IL-8、TNFα、TGF等。因此单纯通过细胞因子谱的变化难以有效识别Th1和Th2细胞。

根据T辅助淋巴细胞（CD4）分泌的细胞因子谱（cytokine profiles）的不同,将CD4细胞分为Th1和Th2亚群。Th1细胞主要分泌γ-干扰素（IFN-γ）、白细胞介素-2（IL-2）和肿瘤坏死因子-β（TNF-β）,介导细胞免疫应答；而Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-10及IL-13等因子，促进抗体的产生，介导体液免疫反应。在多数免疫反应中，T辅助淋巴细胞并不产生典型的Th1或Th2细胞和相应的细胞因子，而主要是由Th0细胞分泌的混合型的细胞因子。但在疾病的状态下，Th0细胞受特异抗原的刺激时，一方面向Th1方向发展，另一方面可能向Th2方向发展。如在结核感染转状态下可产生Th1和Th2双向免疫反应，在I型超敏反应疾病时主要产生以Th2为主的免疫反应。近几年来研究发现，Th1/Th2平衡失调参与多种疾病过程，如肿瘤免疫、移植免疫及变态反应等，而用流式细胞仪进行Th1/Th2的检测克服了传统方法所得结果为整个群体分泌数值不能区分单个细胞或亚群的反应的不足，通过表面染色多参数分析可以区分表达特定细胞因子的细胞亚群。一般用CD3⁺/CD4⁺  或CD3⁺/CD8^-作表面标记，选择相应的荧光标的抗体，Th1和Th2细胞分泌细胞因子的情况如下：

全血标本经过刺激培养、表面标记、固定、破膜、胞内染色（IQ，Cytodetect™kit（basic），CAT方法，IQP-367）后结果如下：

正常全血标本用流式细胞仪检测细胞因子的参考值

一批健康志愿者的全血用PMA+Ionomycin刺激5小时后，按照操作程序测得参考值如下：

第四部分　流式细胞术分析血小板

流式细胞术分析血小板

血栓性疾病、出血性疾病、心血管疾病以及自身免疫性血小板减少症等疾病的病理生理过程与血小板相关。血小板功能检测包括黏附、聚集和活化功能试验。使用流式细胞仪检测全血中血小板表面相关标志物是一种新技术，它拓宽了血小板相关疾病的诊断与功能研究方法，丰富了血小板功能评估指标。

一、流式细胞仪血小板分析应用范围

1.　通过分析信号传递、细胞骨架结构、颗粒释放、糖蛋白构形、膜磷脂、与抗凝因子的结合和微粒形成，分析血小板活化，血小板对刺激物的反应性。

2.       通过分析受激后表面结合蛋白触发凝血链式反应和表面糖蛋白缺陷检测，分析血小板止血功能的获得性和遗传性缺陷。

3.       结合血小板大小，检测血小板RNA含量，分析血小板成熟度，计数网织血小板。

4.       发现血小板抗体，做定性和定量分析。

二、血小板分析的临床意义

1.           血栓性疾病：活化血小板的检测能预测冠状血管成形术后发生急性缺血事件的危险性，非风湿性心房纤颤患者栓塞和栓塞前期均有血小板活化，胰岛素依赖性糖尿病，子痫前期，外周血管疾病等均可测出血小板活力增加和（或）循环中存在活化血小板，而早产儿的血小板对凝血酶、二磷酸腺苷（ADP）、TXA2的体外激活能力降低。

2.           血小板缺陷性疾病：全血法流式细胞术提供了一个简单、迅速的方法来诊断血小板膜糖蛋白缺陷性疾病，如巨大血小板综合征，血小板无力症等。前者是由于GPIb-IX复合物先天缺陷所致的血小板形态巨大，功能异常的出血性疾病。后者由于GPⅡb/Ⅲa复合物先天缺陷，导致血小板聚集功能障碍

3.       贮存池疾病：原发性贮存池疾病（δ-SPD）常规用血小板聚集法检测，但特异性和灵敏度均不理想。检测血小板致密颗粒的阿的平荧光显微镜法，主观性大，操作繁琐，而且一次检测的血小板数目有限。全血法流式细胞术为δ-SPD的诊断提供了一个简单、迅速的方法，一次能定量检测5 000个以上阿的平染色的血小板。与正常人相比，δ-SPD患者阿的平染色显著下降（从49%降至15%）。常在骨髓增殖异常综合征和晚期肾衰中出现的获得性致密颗粒贮存池疾病，也能用全血法流式细胞术进行检测和诊断。

4.           血小板减少性疾病：破坏过多或生成减少均能导致血小板减少。血小板相关抗体（PAIg）是反映血小板的破坏的指标，虽然其临床意义仍有争议。PAIg的检测有多种方法，但流式细胞术法有其优越性。流式细胞仪能测定单个血小板上的PAIg，只要测定104甚至103个血小板，在统计学上就能地得出PAIg的平均水平，因而用血量少，只要1 ml血液制备的血小板就足够。流式细胞术还能同时测定其他一些反映血小板破坏的指标，如PAIgG、PAIgM、C3等。血小板的生成与巨核细胞有关，全血法流式细胞术能像检测网织红细胞那样，检测分泌到循环中的“网织”血小板，来判断血小板的生成。“

5.           血小板储存与输注：用P-选择素（CD62）、CD63、GPⅡb/Ⅲa作分子标志物，发现血库中储存血小板有时间依赖性的活化现象。储存5天以上，40%～60%血小板表达活化标志CD62。虽然其形态改变、乳酸脱氢酶泄漏以及β-TG的释放也能反映其活化，但用CD62作为储存血小板的质量控制指标zui理想。活化的血小板在循环中的存活时间很短。若血小板在储存时活化了，即使输注也不能很好地提高患者止血能力。

6.           抗血栓药物的监测：活化血小板的检测可以判断患者是否需要抗血栓药物治疗，也可以监测这些抗血栓药物的作用，避免毒副反应的发生。

7.           此外，全血法流式细胞术还可用于检测血小板聚集，研究其免疫表型HPA-Ⅰa，测定严重血小板减少患者的血小板数目。

三、流式细胞仪分析全血中血小板的优点

1.　全血中血小板更接近生理状态。

2.       操作简便，减少由于操作造成的血小板状态改变（如血小板活化试验）。

3.       同时检测血小板的多个标志物，结合FSC和SSC，评估多个参数，进行定量分析。

4.       多采用血小板特异抗体CD41或CD61画门，找出血小板，避免杂质碎片的干扰。

5.       检测血小板亚群灵敏度高。

6.       用血量少。

7.       无放射性污染。

四、全血样本的制备

1．抽取抗凝全血：检测血小板功能时，应使用标准化的抽血规程。做血小板活化试验时，应尽量减少人为造成的血小板活化。

2．Falcon管中加取全血和适量直标荧光抗体，充分混匀，室温避光处反应，通常放置15分钟。

3．1%多聚甲醛固定样本。

4．上机检测

五、质控标本

1.　阴性对照（Isotype Control）：非特异荧光的强弱取决于抗体浓度、单克隆荧光抗体特异性和纯度，应与试验管抗体相对应。在多色分析时，同型对照应与其它抗体同时使用，以避免补偿造成的误差。

2.            血小板体外活化试验：使用正常人活化标本作为阳性质控。使用正常人未活化标本作为阴性质控。

3.            血小板自身抗体检测：使用含有已知血小板抗体的血清与血小板孵育，作为阳性质控。使用不含血小板抗体的血清与血小板孵育，作为阴性质控。

4.            血小板表面抗原缺失：如巨血小板症血小板表面CD42a/CD42b缺失，血小板无力症血小板表面gpIIb/IIIa，即CD41/CD61缺失或异常。使用正常人标本做阳性对照，抗体的同型对照做阴性对照。

六、数据分析－设门：

1.　FSC-SSC点图中找出血小板，缺点是血小板较小，不易通过大小将碎片或杂质完全分开

2.       从CD41或CD61-SSC点图中画出血小板门，由于特异性高，可以有效地去除碎片和杂质的干扰。

流式细胞仪分析血小板的活化

血小板活化试验，对于血小板功能、心血管疾病的研究，有重要意义。使用流式细胞仪进行多参数分析，可以特异灵敏地检测血小板表面标记，了解血小板的活化状态和反应性，并同时获得更多关于血小板的信息。在疾病监测、抗血小板治疗病人的筛选及治疗监测、预测并发症等方面有良好的应用前景。

一、使用流式分析方法检测血小板活化的优点是：

1.检测血小板的反应性。

2.了解血小板活化进程。血小板先发生膜糖蛋白变化，然后是胞浆内颗释放到血小板外。

3.     同时检测多种血小板表面标志。

4.     高度灵敏。

5.     直接检测血小板的多种标志。

6.     使用全血，标本量少。

7.     操作简便快捷，将血小板人工激活减至zui低。

二、全血中活化血小板的检测

1.       血小板特异性膜糖蛋白：血小板膜糖蛋白已被深入研究，下表显示了血小板膜上主要的糖蛋白及其功能。在这些膜糖蛋白中，仅在血小板膜表面表达主要有GPⅠb，GPⅡb，GPⅢa等有限的几种，根据这些特异性糖蛋白制备的荧光单抗，能在全血中特异性地识别血小板。

表1　血小板膜上主要的糖蛋白及其功能

注：vWF血管性假血友病因子；Fb纤维蛋白原；Fn纤维粘连蛋白；

Vn体外粘连蛋；LRG富含亮氨酸家族

2.       活化血小板的标志物：活化血小板与静息血小板相比，其质膜糖蛋白常发生显著的变化，这些变化的糖蛋白便成为活化血小板的检测标志物,这些标志物可分为三类：*类是血小板颗粒膜上的糖蛋白。血小板被激活时，其颗粒膜与质膜发生融合，颗粒膜蛋白，如CD62、CD63，在质膜上表达，成为活化血小板的分子标志。第二类是血小板质膜表面变化的糖蛋白表位。如GPⅡb/Ⅲa（CD41/61）的PAC1表位，它仅在血小板活化时才因构象变化而显露出来。因此，使用这个表位的荧光单抗，我们能更地在更早阶段检测到血小板的活化。另外，GPIV （CD36）虽然在静息血小板上也表达，但活化血小板上表达量更高；GPIb-IX-V复合物（CD42）则相反，与静息血小板相比，活化血小板上表达量显著降低。第三类是出现在活化血小板上能与血小板表面受体相结合的一些抗原，包括纤维蛋白原，Xa因子和thrombospondin等。这些抗原在血小板表面的出现和消失在临床检测上也是有意义的。

3.       除检测免疫性的分子标志物外，流式细胞术还能检测一些反映活化血小板功能的非免疫性指标。如用Ca2+浓度敏感的荧光染料检测胞内Ca2+流，用能进入血小板致密颗粒的荧光染料阿的平来检测活化血小板的释放功能等。

4.       单抗的选择：与血小板有关的CD单抗有CD9，CD31，CD36，CD41a-b，CD42a-d，CD61（特异的泛血小板表面标记，既与活化血小板结合，也与未活化血小板结合。CD61与CD41联合，即为血小板表面gpⅡb/Ⅲa复合物），CD62，CD63 ，CD107a-b等，。活化血小板的检测需选择针对活化血小板标志物的CD单抗。表2列举了活化血小板检测的一些代表性单抗。

表2　活化血小板CD单抗简介

三、操作步骤

1.      标本采集：

（1）     枸橼酸钠抗凝的真空采血管顺序编号。

（2）     抽取静脉血，采血管中注入2ml。

（3）     于10分钟之内完成血小板激活和染色步骤，操作时应注意减少人工激活。

2.      血小板激活：

（1）     试管内加入50mlADP（也可选用其他激活剂，如PMA、纤维蛋白、TRAP），450ml全血，轻轻摇匀。

（2）     室温孵育5分钟。

（3）     立即染色。

3.      荧光抗体染色：

（1）     Falcon管编号。

（2）     在对照管中加入同型对照、CD61、PAC－1和RGDS（PAC－1的阻断剂）。

（3）     在试验管中加入CD62P、CD61和PAC－1。

（4）     在对照管和试验管中各加入未激活或激活的血标本5ml。

（5）     轻轻混匀，室温暗处孵育15-20分钟。

（6）     各管中加入1ml冷的固定液 （2-8°C），充分混匀， 2-8°C阴暗处放置30分钟。

（7）     24小时内上机分析。

4.      结果分析：

在CD61 vs SSC点图中设门找血小板群。 CD61 vs SSC 点图显示有三群，

CD61阳性/低SSC一群主要由单个血小板组成，CD61阳性/高SSC一群主要由黏附血小板的血细胞组成， CD61阳性/散射光更低的一群主要由血小板来源的

碎片组成。由于在生理和病理情况下，血小板群和红细胞群的大小、颗粒度会有交叉，因此，不建议使用FSC-SSC图设门。    在CD61 vs SSC点图中找出CD61 阳性的血小板群 （单个血小板和黏附在WBC上的血小板），设门。

四、注意事项

1.       采血时请用大号针管，抽出的前2ml血应弃去不用。

2.       尽量避免标本受到物理振动。

3.       取血后10分钟内完成染色操作。

4.       在Falcon管中加血标本5ml，管壁上不能有残留血，未染色的部分会影响试验结果。

5.       为了检测和控制血小板体外激活，建议使用正常未受激活的血标本平行做质量控制。