开发具有快速、原位特点鉴定并表征蛋白结构的技术是基于质谱的蛋白组学研究面临的迫切需求，但是在狭窄空间中很难同时完成多种任务。在2019年10月16日，发表在Nature Communications上的题为“Nanosecond photochemically promoted click chemistry for enhanced neuropeptide visualization and rapid protein labeling”的文章提出一种纳秒级光化学点击反应技术（nanosecond photochemical reaction，nsPCR）,在纳秒内按需移除周边基质，标记蛋白表面伯胺基团，可对复杂组织样品如鼠脑组织中神经肽进行识别并鉴定。因NBA对伯胺基团特异性标记，有望鉴定分子量达155 kDa的蛋白，累计标记效率远高于90%。改论文通讯作者是美国威斯康星大学李灵军教授，第一作者是该组博后李功玉博士。
nsPCR原理是NBA在激光纳秒照射下，生成的亚硝基苯甲酸根（2-nitrosobenzoic anion, NS-）和H+形成微电场热梯度，在3-5 ns内和20-50μm范围内，带电生物分子（肽段/蛋白）留在辐射中心，小分子基质迁移至外围，电中性分子沿着热力学梯度分布，通过提高氢离子水平来竞争去除基质，同时NS-标记游离伯胺基团。
首先，文章作者利用NBA-based-nsPCR按需去除基质的特征提高了基于质谱成像（MS-based imaging，MSI）的灵敏度和分辨率。以脑组织中神经肽和脂质为例，对照组与实验组比较，发现nsPCR提高神经肽识别的同时不影响脂质识别，增强神经肽空间分布可视化。
接下来，作者用肽段晶体评估基于NBA分子的nsPCR标记通量和效率，下图d和e图中11号肽段峰的同位素分布证实标记结果高分辨率和高准确性，b，c，d图证实同时对多个肽段、蛋白标记的可行性。为了将标记应用于真实生物样本中，本文优化了反应条件，发现降低pH值有助于对肽段完全标记，通过分析标肽和复杂体系蛋白酶解样品的二级碎片，观察到NS-对赖氨酸残基和N端伯胺基团标记的特异性，证实NBA-based-nsPCR可用于计算真实生物样本的标签个数。计算标记前后峰强度，发现对于大多数肽段，标记效率远高于60%-90%。
除了对肽段的标记，基于NBA分子的nsPCR也可对蛋白表面游离伯胺标记，为了验证可行性，对一系列有不同空间构象的蛋白进行加热前后的标记，发现蛋白分子量与平均标记NBA个数总体趋势呈正相关。对于加热后展开的蛋白，游离伯胺与标记个数呈高度线性相关，斜率未达到1表明蛋白仅部分展开。预测计算方法默认蛋白游离伯胺暴露25%为蛋白是暴露的（Protein Surface）。预测结果与实验结果对比发现，基于NBA分子的nsPCR标记结果大概接近于该软件预测值的50-60%，表明基于NBA分子的nsPCR的方法可以成功探测到蛋白表面暴露在40-50%左右水平的赖氨酸残基。
最后，基于NBA分子的nsPCR除了对分子量从599 Da-155 kDa的肽段/蛋白进行高通量和高效的标记，还可以将方法拓展至实际条件下蛋白结构相关的研究，本文用基于NBA分子的nsPCR研究末端唾液酸化对小鼠转铁糖蛋白的结构影响，加入探针后发现唾液酸化比去唾液酸化蛋白少6个探针标记，证明去唾液酸化后蛋白暴露出更多表面伯胺基团，而使用离子淌度质谱比较唾液酸化和非唾液酸化的结构改变呈现的谱图结果改变较小，进一步突出nsPCR技术作为结构生物学补充工具的潜在实用性，能探究蛋白翻译后修饰的动态变化和提高蛋白结构改变敏感性。
总结：本文提出一种纳秒光化学点击反应探针，通过移除周边基质，能够快速、原位识别蛋白同时探究结构，改进原位定量成像分析和组织蛋白质组学，进一步拓展基于激光化学标记方法的实用性和应用范围。
对于该研究的应用，李功玉博士与我们分享了他的见解和展望：本研究报道的技术集分离、化学修饰反应和大分子离子化于一体，有效提高了质谱检测蛋白和快速结构探测的实用性和可应用范围。预期后续基于该探针还有丰富的应用工作可以开展，包括对含有氨基官能团的小分子代谢物的原位快速检测、定量和成像。此外，还需要进一步优化各种条件以实现对目标分子最优标记效率的获得。在此，李博士与我们分享了审稿人对工作的部分评论：
“Although the photochemical click reaction used in this work (NBA tagging on amine) is not unique but developed by others, author’s ideas which use such reaction for in-source tagging of proteins and peptide during MALDI process is brilliant. ”
“It is pretty simple and convenient and therefore has enormous potential as an MS-based analytical tool. Especially for protein cases, the number of tagged NBA can be a measure of folding, which is potentially very useful in the field of biophysics and structural biochemistry. ”
“Authors presented a beautiful correlation between the number of tagged NBA and the degree of protein folding. I think this handy and simple nsPCR approach can potentially promote MALDI-MS as a robust tool for the structural study of proteins.”
“The idea of in situ biomolecule labeling in the MALDI experiment is not a new one, but I have never before seen it so elegantly demonstrated.”
李灵军，通讯作者，美国威斯康星大学麦迪逊分校药学院教授，2000年于美国伊利诺伊大学香槟分校获得化学博士学位, 之后在美国太平洋西北国家实验室和布兰迪斯大学进行博士后研究。2002年起在美国威斯康星大学麦迪逊分校任教。现任威斯康星大学麦迪逊分校药学院和化学系双聘教授，获威斯康星大学Charles Melbourne Johnson药物科学与化学杰出讲座教授和Vilas 杰出成就教授称号。李灵军教授长期致力于生物分析科学以及质谱相关技术的研究, 主要涉及的领域有神经肽组学、蛋白质组学、代谢组学等, 并应用这些尖端的分析方法和技术解决神经生物学、基础和临床医学中的关键性问题。
李灵军课题组（已毕业46位博士生，22位在读博士生，6位博士后）在生物分析化学领域的贡献主要在构建基于高灵敏度质谱多维分析平台, 并应用此平台于新型神经肽组学研究, 在高水平杂志上发表论文280多篇, 受邀学术报告200余场。李教授先后被授予分析化学个人成就奖（匹兹堡会议）、美国国家科学基金委生涯奖、美国质谱学会研究奖、斯隆基金会研究奖, 以及2014 年Biemann Medal。2016年入选全球50位最有影响力女分析化学家。2019年 入选分析科学家Top 100 Power List (全球100位最有影响力的分析科学家)。李灵军教授现任美国质谱学会（JASMS）副主编和分析与生物分析化学（Analytical and Bioanalytical Chemistry）编委会成员。
李功玉，第一作者，现为美国威斯康星大学麦迪逊分校李灵军教授课题组博士后，曾在中科大黄光明教授课题组攻读博士学位期间（2012年 -2017年）开始学习质谱，并在2016年和2019年先后两次访问美国密歇根大学Brandon Ruotolo教授实验室学习离子迁移质谱。自2017年8月加入李灵军课题组以来，李博士的主要研究兴趣包括开发基于离子迁移质谱和敞开式大气压质谱的原位蛋白质质谱新方法，用于解决人类疾病相关蛋白质在复杂体系中的直接鉴定和快速结构分析的技术难题及相关拓展应用。鉴于其在原位蛋白质质谱领域的创新性研究成果，李博士于2019年被美国质谱学会授予该年度博士后职业发展奖（2019 ASMS Postdoctoral Career Development Award）。
作者：朱银雪、李功玉
修订：陆高远、叶慧
文章引用：doi: 10.1038/s41467-019-12548-0
首页
