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瑕瑜:用化学反应的灵感改造质谱 解决脂质组学的难题

2019-10-31 13:16

  质谱在现代科学研究中正发挥着日益重要的作用。分析化学家使用质谱,研究基础科学和应用技术领域的挑战性课题,做出有影响力的工作。随着社会与经济的迅猛发展,科学仪器研发与应用研究从未像今天这样如此紧密地联系在一起。对质谱而言,仪器研发、分析方法与应用研究正成为相互推动、共同发展的有机整体。质谱仪器或关键部件的研发常常会引领一个全新的应用领域,而质谱分析方法学上的创新也会导致全新分析装置与流程的产生,从而系统解决已有分析方法面临的问题。近期,清华大学瑕瑜教授将光化学反应与LC-MS完美结合,首次实现了复杂生物体系中碳碳双键(C=C)位置异构体的大规模、精确结构鉴定与定量,解决了脂质组学研究中长期未能解决的关键性问题,并开发了自动化数据处理软件及分析流程。不久前,分析测试百科网记者采访了瑕瑜教授,听她详解这一重要工作。作为留学归国的学者、质谱的用户,她对使用布鲁克timsTOF以及质谱仪器本身的发展也有真知灼见,希望对所有关注质谱及其应用的读者有所启发……

清华大学瑕瑜教授

发明PB反应装置和流程

  “我的研究方向是生物质谱,以发展新的质谱研究方法为手段,对生物分子特别是其同分异构体进行定性定量。” 瑕瑜首先简要介绍了自己的研究工作。

  比如,由于细胞中有多种脂质合成代谢路径,脂质分子常出现C=C双键位置异构体。这类脂质异构体具有相同的质量,但却承担着不同的功能。如何在不饱和脂质中有效定位C=C双键并对C=C位置异构体做定量是一个难题。目前,商业质谱仪器所配备的MS/MS方法(碰撞诱导裂解,CID)难以产生和双键相关的碎片离子。因此,大部分脂质组学研究仅能完成脂肪酰水平下的鉴定,无法定位及区别C=C双键的位置及相应的脂质C=C异构体。

  瑕瑜课题组根据其开展的溶液自由基化学的研究基础,通过将光化学反应——Paternò-Büchi(PB)反应,将脂质分子中的C=C键选择性衍生化。PB 反应产物在CID条件下可高效生成与双键位置相关的碎片离子。这种方法能够识别多种不饱和脂肪酸和其它含不饱和脂肪酰基的复合脂质。对大鼠、小鼠等啮齿动物的组织分析显示,肿瘤组织中某些同分异构体水平升高,意味着这项技术有可能应用于生物医学领域。

  注:PB反应是羰基化合物与烯烃的[2+2]光环化加成反应,该反应从50年代初建立,利用其特殊的区域及立体选择性可以合成一些结构精巧的取代氧杂环丁烷。

  当PB反应的产物离子化时,由于衍生化所产生的四元环张力较大,导致衍生产物很容易在C=C位置裂解。采用PB-MS/MS这一方法,只需要通过常规质谱的低能CID功能即可实现脂质分析与定量。这种方法的分析流程非常简单,便于操作:实验装置仅需一个紫外灯(254 nm),电喷雾电离(ESI)管路以及作为ESI溶剂的丙酮。

双键衍生与质谱分析在线联用,实现脂质双键位置鉴定

  该光化学反应与常规LC-MS结合后形成的整套分析流程包括液相色谱分离方法、数据收集、结构解析和配套的质谱数据处理软件(Lipid Omega Analyzer,LOA)。利用这项技术,瑕瑜教授课题组揭示了牛肝脏中200多种不饱和甘油磷脂的C=C位置,并鉴定出55组C=C位置异构体。通过对乳腺癌患者和2型糖尿病患者血浆样本的分析,发现C=C同分异构体的比例受个体丰度的影响较小,表明同分异构体组成有成为脂类生物标志物的潜力。不久前,该工作发表在《自然.通讯》上。

PB脂质分析法诞生的灵感和未来前景

  瑕瑜表示:将PB反应用于双键衍生是个偶然,此前课题组一直关注的是自由基和双硫键(S-S)的反应。自 2013年起,课题组才启动自由基和碳碳双键反应方面的研究。当时在普渡进行博士后研究的马潇潇老师发现在254 nm紫外辐射下丙酮可与脂质中的C=C发生环化,形成氧杂环丁烷四元环随后,该反应在脂质C=C定位上的潜力被迅速挖掘,最终发表在以他为第一作者的2014年《德国应用化学》上。以此为基础,课题组后续又发展出了脂质C=C异构体的定量分析方法,用于小鼠乳腺癌肿瘤组织中脂质异构体组成的分析,并发现其有潜力作为肿瘤的生物标记物。目前,马潇潇老师在清华大学精仪系担任助理教授。最近他还独立发展了其它的衍生化反应,利用单一方法实现了包括C=C及sn位置等的脂质全面结构鉴定与定量,在血浆、细胞和疾病组织的生物医学分析上获得了很好的效果,工作很出色。

  发现PB反应是偶然,但给我们很好的启示:我们用原有的质谱方法(如CID)无法有效碎裂、无法获取足够的结构信息,在结合有效的化学衍生后,可以解决以前的分析手段难以解决的问题。这也提示了在组学研究中,我们可能忽视了很多经典的化学反应:如果把它们应用于解决分析化学领域的问题,极有可能会发挥出巨大的威力。

  对于脂质结构的鉴定,比如鉴定异构体或精细结构,除PB反应还有其它一些值得关注的方法,比如位于澳大利亚布里斯班的昆士兰科技大学的Stephen Blanksby教授。Blanksby教授利用臭氧诱导解离(OzID),在质谱仪的离子阱里以臭氧切断碳碳双键。清华大学张新荣、马潇潇和欧阳证教授合作,发现基于低温等离子体(LTP)技术的环氧化反应也可实现不饱和脂质的高效结构解析。

  PB反应耦合LC-MS已形成脂质组学研究的完整工具【1】

在C=C位置水平上鉴定脂质的LC-PB-MS/MS系统原理图。a 关键组件包括:用液相色谱分离脂质,HILIC色谱柱,用丙酮/ACN/NH4Ac (10 mM) 溶液作流动相;由FEP管制成的流动微反应器和低压汞灯(254 nm 发射波长),用于与 LC 和 ESI-MS 在线耦合,不饱和GPs的PB反应产物在CID碰撞后形成C=C诊断离子。b 分析工作流程包括:两次传统的LC-MS/MS,用于在脂肪酰水平下的鉴定;一次LC-PB-MS/MS实验,采用数据依赖方式采集,在C=C位置水平下鉴定脂质。数据分析使用自助开发的程序:Lipid Omega Analyzer

  瑕瑜教授介绍到目前PB反应相对于其它的脂质双键定位技术有几个优势。首先, PB反应发生在质谱外,可以在一分钟之内对上百种脂质分子进行衍生,然后用串联质谱逐一分析,因此分析通量高。其次,PB反应使用方便,无需对质谱仪器进行改造,有利于更多人来使用并发展它。另外,PB反应装置可以与传统的LC-MS在线联用,有利实现高通量的样品自动分析。我们和欧阳证教授合作【2】,不仅实现了与LC-MS的联用,还发展了脂质的从头测序结构分析工具(de novo structure analysis),用于数据采集和自动数据分析。目前为止,其它脂质精细结构鉴定的方法尚停留在研究结果的展示阶段,还没有编制工具包。我们先行一步,同时也向同行表明这是可行的方案。

清华吸引了普渡的一对学者伉俪

  中国的强大不断吸引着优秀人才回国,谈到此,瑕瑜非常高兴:“清华大学化学系享誉国内外,有强大的师资、设备及后勤系统支撑最前沿的科学研究。我非常幸运能加入清华大学化学系。”那为何选择清华大学?瑕瑜坦率回答:“我的先生欧阳证此前已经在清华大学开始工作。由于我们在普渡大学已经有比较紧密的合作,继续在同一所学校对之后的合作会有地域优势。所以非常感谢清华大学化学系给了我这份职位。”

  回到清华后,瑕瑜继续开展自己从2009年就开始的研究。这项研究从基础的自由基化学开始,发展质谱装置,解决当前面临的脂质组学和蛋白质组学的挑战性问题。2019年发表《自然·通讯》文章,其实建立在从2009年开始的工作基础上,开始6、7年主要是从事基础研究,在基础研究方面获得突破后,才形成了在整个技术、以及在组学上的突破。

为什么选择timsTOF?

  布鲁克推出timsTOF,瑕瑜课题组是国内最早的用户之一。谈到这次合作,瑕瑜表示:离子淌度和质谱连接具有提供多维度分析信息和高通量分析的独特优势。我的兴趣是生物分子异构体的结构鉴定,因此自然就想到把现有的结构分析的方法和离子淌度结合起来,解决异构体的问题。当时了解了市场上几种离子淌度质谱仪,选择了timsTOF这种具有离子富集功能的仪器。首先,它和我们今后想进行的仪器改进很匹配,有很多灵活性。分离的原理是通过管状(tube)的离子淌度分析器(体积很小)施加捕集电压和气体,把离子捕集在淌度装置中。此时离子会按照不同的碰撞截面积排列,随后通过改变捕集电压,逐个将离子从大到小地分离出来。TimsTOF也是当时市场上分离效率最高的质谱(淌度分辨率200)。

timsTOF

  其次,由于timsTOF可以储存离子,因此可以在气相中对离子进行多种操作,例如富集低浓度的成分,或者作为反应器研究气相自由基化学。整体而言,timsTOF仪器特点与课题组今后的研究规划高度一致。除脂质外,我们还在开展利用timsTOF平台表征多肽及蛋白二硫键连接异构体、脂质-蛋白的复合物等一系列课题。除了timsTOF外,我们团队还购置了一台Bruker Impact Q-TOF质谱仪做仪器改造。 通过安装波长可调的激光器(200 ~700 nm),在原有碰撞池里实现了紫外光裂解(UVPD)的功能。

正在改装中的Impact

  目前,利用timsTOF已经实现了对含共轭C=C亚油酸的分析,该工作以谢小波博士为第一作者近期发表在《Analytical Chemistry》【3】上。根据之前的报道,丙酮作为衍生试剂与双键发生【2+2】环加成反应,可生成两种PB加成产物(即丙酮的氧原子可分别加在双键两个碳原子上);两种PB产物经串联质谱分析,可得到一对含醛(FA)和烯烃(FO)的诊断离子。谢小波博士发现,与非共轭脂质相比,共轭脂肪酸的PB光化学衍生具有高区域选择性(氧原子均加在共轭体系两端的碳原子上,而非每个C=C的碳原子上);同时,在PB-MS/MS质谱图中,共轭脂肪酸得到诊断离子信号明显高于其非共轭异构体。结合布鲁克公司2016年推出的高分辨捕集离子淌度技术(trapped ion mobility spectrometry, TIMS),可确定双键Z/E构型(如下图所示)。离子淌度数据表明,共轭亚油酸的两个C=C构型在光化学衍生过程中会发生异构化,得到四种构型CLA异构体,并在离子淌度上被分开成两个峰(Z,Z vs E,E和Z,E vs E,Z)。随后,通过引入银离子,与双键配位形成CLA复合物,各构型异构体之间的结构差异进一步增大并可在TIMS上完全分开。相比于传统方法,该方法具有操作简单、分析速度快(< 1 min)和样品用量少等优点。

PB-MS/MS与TIMS联用分析共轭脂肪酸异构体

  谈到最新的timsTOF Pro,瑕瑜表示:它大大提高了MS/MS扫描频率和离子利用率,MS/MS扫描频率可达100 Hz以上;而且它采用双离子淌度设计,第一个淌度做富集,第二个淌度做分离,两个淌度串联的设计将离子利用率提高至近100%,因此灵敏度、鉴定深度又得到大幅提高。所以对组学鉴定,不管是蛋白组学还是脂质组学都非常有好处,今后脂质组学的很多方法学都可展示在timsTOF Pro上。

脂质生物分析与小型质谱

  除了和世界知名的仪器公司合作,瑕瑜和欧阳证教授合作开发了基于miniβ小型化质谱仪器的脂质鉴定研究。瑕瑜表示:“小型质谱体积小噪音低,可能进到手术室或者药店做现场预前诊断。我们在大型质谱仪器上的工作表明:脂质异构体组成和疾病有相关性,而这同小型仪器的特点和应用契合。PB反应和质谱联用的优点是不依赖内标就可在一张谱图上直接测量异构体的相对比例,个体误差仅在15%左右。以异构体的比例作为疾病的潜在标志物,可极大简化实验步骤,缩短检测时间。以上实验可以通过miniβ小质谱配合PB 反应试剂盒来实现。 因此小质谱结合脂质C=C双键位置异构体的测定,是一种双赢的结合。”

  此外,在LC-MS/MS联用方面,清谱和瑕瑜的课题组合作设计了用于PB反应的Ω 反应器和Lipid Ω analyzer数据包。

耦合LC-MS/MS的Ω反应器

对质谱仪器厂家的建议

  谈到对质谱仪器厂家的建议,瑕瑜表示:对比来看,由于质谱的主要生产厂家在美国和欧洲,西方国家工业界的技术人员与学者间的联系更加紧密,合作也更加容易。比如我课题组正在开展的气相离子化学研究需要对质谱仪器做改造,这在美国比较容易,而在中国就比较困难。仪器研发与应用间的良好互动对推动整个科学仪器行业良性、健康发展有着积极意义。希望国内质谱仪器公司加强这方面的工作,提供必要的资源和条件,强化对技术人员的培训,实现工业界质谱仪器研发与学术界基础和应用研究间的实质性合作。谈到在美国大学实验室和质谱仪器公司的合作,瑕瑜也分享了自己的一些体会。不同的公司有不同的策略,有些公司的合作项目主要集中在跟自己的市场战略紧密相关的课题上;有些公司的合作项目则主要关注自己当前不做的、比较前沿、但有长远意义的项目。合作会比较紧密,合作时间甚至会长达十几年。

对中国质谱研发的建议:重视人 重视分析化学

  谈到对中国质谱研发制造的建议,瑕瑜认为最重要的一环是人。技术的复制相对简单,但要做创新、有实用价值的技术,需要研究人员有独特的想法和切入点。我国现阶段受过专业质谱训练的人相对较少,国外的几家大型的质谱仪器公司每年在质谱研究处于前沿地位的大学(例如普渡大学、威斯康星-麦迪逊分校、UIUC等)都大量招博士、博后。这些学校都有多位教授从事与质谱仪器和应用相关的科研,包含了从仪器研发、气相化学、质谱成像、到后端的数据处理等各个方面。他们培养出的博士从理论深度、对学科前沿的把握、到解决实际问题的能力都很出色。因此从国家到学校层面,在引进人才、后续考评、基金等方面加强对质谱领域研究者的支持,对优化质谱研发的生态尤为重要。

  最后,谈到近年来国家经费对仪器设备采购的支持时瑕瑜表示:因为诸多质谱界等科学仪器行业同仁的共同努力,国家通过设立仪器研发专项大幅增加了对仪器研发的支持力度。这必将助力中国质谱研发队伍的壮大发展,对我国早日成为科学仪器强国也将发挥积极作用。

  人物简介:

  瑕瑜教授:1999年获兰州大学学士,2002年获中科院上海药物研究所硕士,2006年获得美国普渡大学化学系博士学位。2007-2009年于普渡大学分别担任博士后和助理研究员的工作。自2009年秋开始,在普度大学化学系担任助理教授并于2015年担任副教授。2016年起任清华化学系教授。瑕瑜教授致力于研究生物大分子气相离子化学和质谱仪器的开发及应用。其团队发展了质谱研究自由基-生物大分子反应的方法,对进一步推动质谱在蛋白、多糖、脂质结构解析的能力上做出了贡献。瑕瑜教授在本领域重要期刊发表论文80余篇, 包括《美国国家科学院院刊》,《美国化学学会志》,《德国应用化学》,《自然·通讯》,《分析化学》等。

  参考文献:

  1.Online photochemical derivatization enables comprehensive mass spectrometric analysis of unsaturated phospholipid isomers. Wenpeng Zhang, Donghui Zhang, Qinhua Chen, Junhan Wu, Zheng Ouyang & Yu Xia. Nature Communications volume 10, number: 79 (2019)

  2.PB反应结缘小型质谱,脂质组学研究再添利器,分析测试百科网

  https://www.antpedia.com/news/96/n-1449696.html

  3.Analysis of Conjugated Fatty Acid Isomers by the Paternò-Büchi Reaction and Trapped Ion Mobility Mass Spectrometry, Xiaobo Xie, Yu Xia, Analytical Chemistry 2019, 91, 11, 7173-7180