细胞培养大攻略8

79、细胞传代消化时所用胰酶浓度越高越好吗？
 

不见得！因为胰蛋白酶溶液的消化能力是和溶液的pH、温度、胰酶浓度及溶液中是否含有Ca++, Mg++离子和血清等因素有关。通常情况下，pH 8.0 ， 温度 37℃其作用能力最强。另外，钙、镁离子及血清均能大大降低其消化能力。我们每次进行传代消化前，一定要用D-Hanks液或PBS液反复冲洗细胞培养瓶，以便于将含血清的培养基冲洗干净，这样就能大大提高消化液的消化能力。本中心通常使用的消化液浓度为：

（1）0.05%胰蛋白酶+0.02% EDTA；
 

（2）0.25%胰蛋白酶+0.03% EDTA；

（3）0.25% 胰蛋白酶
 

溶液pH8.0-9.0；使用D-Hank液配制。
 

多数细胞传代消化可使用0.05%胰蛋白酶+0.02% EDTA这种消化液。

80、培养基在使用过程中应注意的问题
 

（1）培养基在使用前需37℃预热或在室温平衡后再使用。
 

（2）细胞培养过程中，吸取过培养液的吸管不能再用火焰烧灼，防止残留在吸管内的培养基焦化，将有害物质带入培养液中。
 

（3）尽量缩短各种液体、细胞的暴露时间。
 

（4）避免液体间、细胞间的交叉污染。
 

（5）配制完全培养基时，配制的量最好在2周内用完为好。
 

81、血清的有关问题
 

新生牛血清：新出生牛5天内取血制成

小牛血清：小牛出生16周以内采血制成。

胎牛血清：（进口血清）要求剖腹取胎制成。

国内厂家往往不能做到，经常把出生2天以内采血称为胎牛血清。

根据血清的生产工艺及血红蛋白、内毒素含量又分为：
 

（1）.特级胎牛血清：40纳米过滤，内毒素含量≤10 EU，血红蛋白含量≤10 mg/dl。
 

（2）.优等胎牛血清：经过3次100纳米过滤，

内毒素含量≤25 EU/ml，血红蛋白含量≤25 mg/ml。
 

（3）.标准胎牛血清：3次100纳米过滤，低内毒素，

低血红蛋白含量。
 

（4）.活性碳/葡聚糖处理血清：激素含量大大降低。
 

（5）.透析型胎牛血清：次黄嘌呤和胸腺核苷含量大大降低。

82、其他细胞培养用液：除培养基、血清、谷氨酰胺外，其他几种液体也属必须，不可省略。
 

（1）双抗：200倍，（1 ml/支）其终浓度为青霉素100 U/ml；链霉素100 ug/ml，-24 ℃保存。
 

（2）L-谷氨酰胺：100倍，（1 ml/支）， 终浓度2 mM，-24 ℃保存。
 

（3）丙酮酸钠：配制浓度50 mM，4 ml/支，终浓度为1 mM/ml，-24 ℃保存。
 

（4）Hepes液：配制浓度1 M（5 ml/支），一支Hepes加入到200 ml完全培养基中，终浓度为25 mM/ml，常温保存。

83、支原体污染及检测
 

（1）.支原体污染在细胞培养中最常见、不易被查觉，但支原体污染可显著影响细胞功能干扰实验结果。支原体是介于细菌和病毒之间的目前所知能独立生活的最小微生物，它无细胞壁，形态呈高度多形性，最小直径0.2 um，可通过滤器。
 

目前中心通过对国内100余株/系细胞的检测，形势不容乐观。污染率达30% ~ 60% 。课题组从国外引进细胞株/系也经常出现支原体的污染。支原体在污染细胞后，它通过影响细胞的DNA、RNA 的合成及急速消耗培养基中的氨基酸来抑制细胞的生长，并能降低细胞的融合率。因此，在运用各种细胞系进行实验研究时，首先要证明所用细胞有无支原体的污染。
 

（2）.支原体污染后，培养基可不发生浑浊，细胞病变轻微或不明显，因此难以发现。目前，支原体检测的方法有以下几种。
 

（a）.相差显微镜观察；

（b）.低张处理地衣红染色法；

（c）.荧光染色法；

（d）.酶标法；

（e）.PCR法：基础医学细胞中心使用该方法进行检测。
 

优点：灵敏度高，检测耗时短，样品量小

（只需50ul细胞培养用液上清）。

缺点：引物及制剂费用较高。

84、培养液pH 值变化太快
 

可能原因
 

（1）CO₂ 张力不对。
 

（2）培养瓶盖拧得太紧。
 

（3）NaHCO3 缓冲系统缓冲力不足。
 

（4）培养液中盐浓度不正确。
 

（5）细菌、酵母或真菌污染。
 

建议解决方法
 

（1）按培养液中NaHCO₃ 浓度增加或减少培养箱内CO₂ 浓度，2.0 g/L 到3.7 g/L 浓度NaHCO₃ 对应CO₂ 浓度为5％ 到10％。
 

（2）松开瓶盖1/4 圈。
 

（3）改用不依赖CO₂ 培养液。加HEPES 缓冲液至10 到25 mM 终浓度。
 

（4）在CO₂ 培养环境中改用基于Earle′s 盐配制的培养液，在大气培养环境中培养改用Hanks 盐配制的培养液。
 

（5）丢弃培养物，或用抗生素除菌。