荧光显微镜检测支原体
实验方法原理 | 检测支原体有两种不同的策略:第一种方法将在下述方案中述及,利用对 DNA 染色的荧光染料 Hoechst 33258, 它对细胞核周围(在细胞表面或胞质中)的特殊物质进行染色,可显示支原体污染;第二种方法是利用 DNA 探针识别细胞提取物中的 DNA 支原体特异序列,进行支原体污染的检测。对这个方案,照试剂供应商(fisher Scientific) 的说明进行。 |
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实验步骤 | 1) 准备下列液体,然后除菌并冷藏。 无酚红的 HBSS NaCl 8 g KCl 0.4 g CaCl2 0.14 g MgSO4•7 H2O 0.1g MgCl2•6 H2O 0.1g Na2 HPO4•2 H2O 0.06 g KH2PO4 0.06 g 葡萄糖 1.0 g NaHCO3 0.35 g dH2O 1000 ml Hoechst 1000x 贮存液 柠檬酸/磷酸盐缓冲液(2X) 0.1mol/L 柠檬酸 22.2 ml 0.2mol/LNa2 HPO4 27.8 ml 用柠檬酸或 Na2 HPO4 调节 pH 为 5.5。 2) 滴人 1~2 滴胰蛋白酶消化细胞于培养皿中的 Labtek 玻片上或盖玻片。 3) 加人 1~2 ml 培养液覆盖表面,让细胞生长 2~3 天。 4) 准备 Camoy 固定液(应在每次用前制备新鲜的)。 Camoy 固定液 3 份甲醇 1 份冰乙酸 5) 吸干培养液,不用洗涂单层细胞并直接加人 Camoy 固定液于 Labtek 室内或培养皿中。培养皿中充满 Camoy 固定液(约 5 ml)室温中放置平皿 2 分钟。 6) 去除培养皿中液体,加人新鲜固定液以充满室内或培养皿中(约 5 ml)。室温中放置平皿 5 分钟。 7) 重复歩骤 6。 8) 去除固定液,去除 Labtek 室的塑料外套或将培养皿的玻片拿出,让细胞在室温中晾干 30 分钟或更长。 9) 用 Hoechst1000x 储存液(步骤 1) 配制 Hoechst 工作液。 Hoechst 工作液 工作液宜每次新鲜配制 用 10ml HBSS 稀释 0.1 ml Hoechst 储存液(0.5ug/ml) 用 5 ml HESS 稀释 0.5 ml Hoechst 储存液(0.05ug/ml) 或 用 50 mlHBSS 稀释 50ul Hoechst1000x 储存液;每 Coplin 染缸中加人 40 ml。 10) 室温条件下,在 HBSS 配制的 Hoechst 工作液(终浓度为 0.05ug/ml) 中染色玻片 10 分钟。 11) 用 dH2O 漂洗两次。 12) 等体积混和甘油、梓檬酸/磷酸缓冲液(在步骤 1 中制备),制备封闭培养液以覆盖住细胞。 13) 在玻片和盖玻片之间加入 2 滴封闭培养液,用纸巾轻轻吸出多余液体。 14) 用橡胶黏合剂封闭玻片和盖玻片。 15) 用荧光显微镜观察标本。应用激发波长为 330/380nm 和光栅过滤器 LP440nm。 |