实验方法原理 | 以低密度接种细胞,温育直至集落形成,染色与计数集落 |
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实验步骤 | 材料
4.将五种浓度(iii) 的细胞以5ml 培养液接种于Petri培养皿中。另外在两个6cm 的Petri 培养皿中加入2 X 103 个/ml作为对照,以防克隆培养不成功(至少要保证在最大稀释的培养液中有细胞)。 5. 将培养皿中充 5 % CO2 并置于温箱中。 6. 将Petri培养皿放入透明的塑料盒内,最好将盒放人限制通道人口并只用作克隆实验的潮湿的CO2 温箱中。 7. 温育1~3 周直到肉眼可见集落。 8. 用结晶紫染细胞: (a) 将培养皿中的培养液吸走; (b) 用D-PBSA 清洗细胞,弃掉洗液; (c)加入5ml新鲜D- PBSA ,然后加人5ml 甲醇轻柔混匀(小心避免集落漂起来); (d)以新甲醇5ml取代甲醇D-PBSA 混合液(50:50),固定细胞lO min; (e)弃去甲醇,加人过滤过的结晶紫,每6cm 的培养皿2~3ml, 要确保整个生长面被染料覆盖; (f) 染色 lO min。 (h) 撤去染料,过滤后倒人母液瓶中。 9. 计数每个IE 中的集落数,集落中少于50 个细胞的不用计数。放大镜下观察更容易计数。定出一个阈值很为重要,阈值以上者可算作集落,如果大多数的集落在100个和数f 个之间,则每个集落的设定阈值可以是50个细胞。在操作中,用肉眼进行计数是普遍的。然而,当集落数非常小(<100个细胞),则每个集落的设定阈值可以是16个细胞。16个细胞以下者即相当于4 次细胞连续分裂,则很难会有更多的细胞增殖。 |