叶绿素的定量测定实验

2019.11.12

王辉

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实验方法原理

	根据叶绿素对可见光的吸收光谱，利用分光光度计在某一特定波长下测定其光密度，而后用公式计算出叶绿素含量，此法精确度高，且能在未经分离的情况下分别测出叶绿素a、b的含量。根据朗伯－比尔定律，某有色溶液的光密度D与其浓度C及液层厚度L成正比，即： D＝kCL 式中k为比例常数，当溶液浓度以重量百分浓度为单位，液层厚度为 1 厘米时，k称为该物质的比吸收系数。如果溶液中有数种吸光物质，则此溶液在某一波长下的总光密度等于各组分在相应波长下光密度的总和，这就是光密度的加和性。叶绿素a、b在红光区的最大吸收峰分别位于663 nm 和 645 nm，在波长663 nm 下，叶绿素a、b的80％丙酮溶液的比吸收系数分别为82.04和9.27，在波长645nm下分别为16.75和45.6，可据此列出下列关系式：式中的D₆₆₃和D₆₄₅为叶绿素溶液在波长663nm和645nm时的消光度，C_a和C_b分别为叶绿素a和b的浓度，以毫克/升为单位。将C_a与C_b相加，即得叶绿素总量CT。另外，由于叶绿素a、b在652nm处有相同的比吸收系数（均为34.5），也可在此波长下测定一次消光度（D652）而求出叶绿素a、b的总量：
仪器、耗材	新鲜叶片丙酮研钵漏斗天平剪刀烧杯滤纸量筒分光光度计
实验步骤	称取新鲜叶片0.5克，剪碎置研钵中，加少量碳酸钙和石英砂，并加入2-3 ml 80％丙酮，研成匀浆，再加入10 ml 80％丙酮，继续研磨充分，用一层加丙酮湿润过的滤纸过滤，再用少量丙酮将滤纸和研钵上的色素冲洗干净，定容至25 ml 容量瓶中，摇匀。吸取叶绿素丙酮提取液2 ml ，加80%丙酮2 ml 稀释后，倒入1 cm 比色杯中，用分光光度计分别在波长645nm、663nm和652nm下测定光密度，以80％丙酮为空白对照。按公式（3）、（4）、（6）分别计算叶绿素a、b浓度及总浓度（毫克/升）按下式计算叶绿素在叶片中的含量：

根据叶绿素对可见光的吸收光谱，利用分光光度计在某一特定波长下测定其光密度，而后用公式计算出叶绿素含量，此法精确度高，且能在未经分离的情况下分别测出叶绿素a、b的含量。

根据朗伯－比尔定律，某有色溶液的光密度D与其浓度C及液层厚度L成正比，即：

D＝kCL

式中k为比例常数，当溶液浓度以重量百分浓度为单位，液层厚度为 1 厘米时，k称为该物质的比吸收系数。

如果溶液中有数种吸光物质，则此溶液在某一波长下的总光密度等于各组分在相应波长下光密度的总和，这就是光密度的加和性。

叶绿素a、b在红光区的最大吸收峰分别位于663 nm 和 645 nm，在波长663 nm 下，叶绿素a、b的80％丙酮溶液的比吸收系数分别为82.04和9.27，在波长645nm下分别为16.75和45.6，可据此列出下列关系式：

式中的D₆₆₃和D₆₄₅为叶绿素溶液在波长663nm和645nm时的消光度，C_a和C_b分别为叶绿素a和b的浓度，以毫克/升为单位。

将C_a与C_b相加，即得叶绿素总量CT。

另外，由于叶绿素a、b在652nm处有相同的比吸收系数（均为34.5），也可在此波长下测定一次消光度（D652）而求出叶绿素a、b的总量：

仪器、耗材

新鲜叶片丙酮研钵漏斗天平剪刀烧杯滤纸量筒分光光度计

实验步骤

称取新鲜叶片0.5克，剪碎置研钵中，加少量碳酸钙和石英砂，并加入2-3 ml 80％丙酮，研成匀浆，再加入10 ml 80％丙酮，继续研磨充分，用一层加丙酮湿润过的滤纸过滤，再用少量丙酮将滤纸和研钵上的色素冲洗干净，定容至25 ml 容量瓶中，摇匀。

吸取叶绿素丙酮提取液2 ml ，加80%丙酮2 ml 稀释后，倒入1 cm 比色杯中，用分光光度计分别在波长645nm、663nm和652nm下测定光密度，以80％丙酮为空白对照。

按公式（3）、（4）、（6）分别计算叶绿素a、b浓度及总浓度（毫克/升）

按下式计算叶绿素在叶片中的含量：

叶绿素/定量测定

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