实验方法原理
氯化三苯基四氮唑(TTC)是标准氧化还原电位为80毫伏的氧化还原物质。溶于水中为无色溶液,但还原后通过下列反应,生成红色而不溶于水的三苯基甲臢。反应式如下: 生成的甲臜呈稳定的红色,不会被空气中的氧自动氧化。所以TTC被广泛地用作酶试验的受氢体。植物根引起的TTC还原,可因加入琥珀酸、延胡索酸、苹果酸得到加强;而被丙二酸、碘乙酸所严重抑制。所以,它能够测定脱氢酶的活性。由该酶活性表示根系活力。 | |
实验材料 | |
试剂、试剂盒 | |
仪器、耗材 | |
实验步骤 | 一、仪器设备: 721型分光光度计;温箱;研钵;漏斗; 移液管:0.5 ml 1支、5 ml 3支、2 ml 1支;容量瓶(10 ml )8个; 二、试剂: 1.乙酸乙酯(分析纯); 2.连二亚硫酸钠(Na2S2O4),分析纯,粉末; 3.1%TTC溶液:准确称取TTC1.0000克,溶于少量水中,定容到100 ml 。用时稀释至需要浓度。 4.0.1 M pH7.5磷酸缓冲液。 5.2N硫酸:用量筒取比重1.84的浓硫酸55 ml ,边搅拌边加入盛有500 ml 蒸馏水的烧杯中,冷却后稀释至1000 ml 。 三、材料: 水培或砂培的玉米或小麦根植物材料(需洗净)。 四、方法步骤: TTC标准曲线制作: 取0.2 ml 0.5%的TTC溶液加入到10 ml 具塞刻度试管中,再加入少许Na2S2O4粉末,摇匀后即产生红色的甲臜。再用乙酸乙酯定容至刻度,摇匀。然后分别取此液0.25、0.50、1.00、1.50、2.00 ml 至10 ml 具塞刻度试管中,以乙酸乙酯定容至刻度,即得到含甲臜 0.025、0.05、0.10、0.15、0.20毫克的标准比色系列。以空白作参比,在485n M 波长下测定光密度,绘制标准曲线。 定性测定方法: 取样品0.25g放入三角瓶,加入0.5%TTC溶液和0.1 M 磷酸缓冲液(pH7.5)各5 ml 充分混匀,并将根尖完全浸入在溶液中,至37℃保温箱内1小时,保温时间一到立即加入2N H2SO4溶液2 ml 以终止反应。如根尖显红色表明该处具有活跃的脱氢酶存在。 定量测定方法: 取出定性显色的根段,用滤纸吸干外附水分,至研钵中,加乙酸乙酯3-4 ml 研磨。将提取的红色TTF小心倒入刻度试管中,残渣用乙酸乙酯冲洗2-3次,直至洗液不带红色为止,全部洗液合并于试管中,最后用乙酸乙酯定容至10 ml ;摇匀后,以乙酸乙酯为对照于485n M 下比色,记录光密度值。查标准曲线,即可求出TTC还原量。
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