本阶段是组织培养中最重要的一环。在培养基中植物激素的作用下，外植体通过三条途径迅速增殖，这就是侧芽增殖、诱导不定芽的形成和诱导胚状体的形成。
侧芽增殖
种子植物的每个叶腋中通常都存在着腋芽，在一定条件下可以使它生长。现在知道顶端优势抑制侧芽生长，可被外源的细胞分裂素打破，所以在利用侧芽增殖这条途径时，培养基中几乎都要加入细胞分裂素（有时也加入少量生长素）。由于细胞分裂素的持续作用，侧芽不断分化和生长，逐渐形成芽丛。如果反复切割和转移到新的培养基上继代培养，就可在短期内得到大量的芽。
侧芽增殖的主要优点是能保持遗传的稳定性，因为茎尖的细胞常是均一的二倍体细胞，它不易受培养条件的影响而发生变异，也易于保持嵌合体的性状。目前已有近百种植物可以用这种方法进行繁殖，如草毒（Fragaria ananassa Duch.）、苹果、葡萄（Vitis vinifera L.）、唐菖蒲（Gladiolus gandavensis Houtt.）、非洲菊、月季（Rosa chinensis Jacq.）、甜菜（Beta vulgaris L.）和凤梨[Ananas comosus(L.) Merr.]等。
关于培养基中加入细胞分裂素的浓度，是0.1～10.0毫克/升，一般为1.0～2.0毫克/升。在几种细胞分裂素中用的最多的是6-苄基嘌呤，其次是激动素和异戎基腺苷，玉米素用的很少。
除了细胞分裂素之外，在培养基中还经常加入低浓度的生长素以促进腋芽的生长。常用的生长素是萘乙酸、吲哚丁酸和吲哚乙酸（浓度为0.1～1.0毫克/升）。
不定芽的诱导形成
在自然条件下，很多种植物的器官可以产生不定芽。在培养条件下，由于所需要的外植体很小又加上激素的作用，可以使这种产生不定芽的能力得到极好的发挥，如秋海棠或非洲紫罗兰（Saintpaulia ionantha Wendl.）用常规的叶插法繁殖时，每片叶只能产生几个到十几个芽，但用叶切段在培养基中可产生成千上万个芽。在培养条件下，还能使自然条件下不产生不定芽的器官形成不定芽，如卷心菜（Brassica oleracea L.var.capi-tata L.）和番茄（Lycopersicon esculentum Mill.）的叶、菊花[Dendranthema morifolium（Ram.） Tzvel.]的花和叶片、百合（Lilium brownii F.E.Br.var.viridulum Baker）和水仙的鳞片以及萱草（Hemerocallis fulva L.）的花茎等。
在诱导外植体形成不定芽时，一般使用细胞分裂素高于生长素比值的激素配比，少数情况下也采用二者比值接近1的配比。常用的细胞分裂素是6-苄基嘌呤，激动素和玉米素，浓度范围一般在0.1～10.0毫克/升。生长素是萘乙酸、吲哚乙酸和吲哚丁酸，其浓度范围与细胞分裂素相同。为了使外植体形成不定芽，外源激素的供应只是一个方面，器官分化的性质还要决定于内源激素的状况。因此，对于不同的植物，使用的激素种类和浓度常有较大的变化。在具体操作时，应参考已有资料或相近种类的已有结果，以确定适当的浓度和配比。
胚状体的诱导形成
在自然界只有少数植物可以由珠心产生胚状体。在培养条件下，现在已有30多个科的150多种植物可以产生胚状体。在诱导胚状体的形成时，其外植体一般取自胚、分生组织或生殖器官。为了获得胚状体，在培养过程中，培养基中应含有丰富的还原氮，并加入生长素（主要是2，4-D）诱导胚状体的发生。待胚状体发生后，要转移到降低浓度或没有生长素的培养基上进行培养，使胚状体成熟和生长。
胚状体途径的优点是增殖率高，而且胚状体既具胚芽又具胚根。因此，可免去生根这一步骤。但目前很多重要作物还不能形成胚状体，或产生的胚状体难以形成植株，另外胚状体遗传性也容易发生变异，所以目前除柑桔（Citrus）、油棕（Elaeis guine-ensis Jacq.）和咖啡（Coffea）等少作物外，都不采用这一途径。
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