普鲁卡因小鼠腹腔注射LD50的测定

   【目的】通过实验学习测定药物LD₅₀ 的方法、步骤及计算过程，观察受试药品一次给予动物后所产生的急性毒性反应和死亡情况。

     【原理】药物给药剂量与动物死亡率间呈正态分布，以对数剂量为横坐标、死亡率为纵坐标作图，可得到一对称S型曲线，其两端较平坦，中间较陡，说明两端处剂量稍有变化时死亡率的改变不易表现出来，在50%死亡率处斜率最大，该处剂量稍有变动时，其死亡率变动最明显，即最灵敏，在技术上也最容易测得准确，所以人们常选用LD₅₀ 值作为反映药物的指标。若将死亡率换算成机率单位，则对数剂量与机率单位呈直线关系，用数学方法可拟合其回归方程式，可精确地计算LD₅₀ 及引起任何死亡率的剂量及相关数据。

   【器材】注射器（1ml）、天平、小鼠笼、苦味酸。

   【药品】盐酸普鲁卡因

   【动物】18 ～ 22g健康小鼠50只(正式试验)，雌雄各半（雌鼠应无孕），实验前禁食12h，不禁水。

   【方法】

    1.预试验   目的是寻找引起0%和100%动物死亡的剂量范围，以便正式实验时确定各组剂量。一般是取小鼠9～12只，分3～4组，选择组距较大的一系列剂量腹腔注射给药，观察出现的症状并记录死亡数，找出引起0%及100%死亡率，至少应找出引起20%～80%死亡率的剂量范围，以保证量-效曲线跨越足够的范围。普鲁卡因小鼠腹腔注射（ip）引起0%和100%动物死亡的剂量范围的参考值为：最小剂量（Dmin）121.3mg/kg，最大剂量（Dmax）  290mg/kg。

   2.剂量计算及药液配制

  (1)剂量计算

根据预试结果找出Dmax及Dmin，设正式实验的剂量组数为n，剂量公比为r，则  

各组剂量为Dmax・r^k-1 ，k为第几组，一般选用4～5组动物，r为0.6～0.85为宜。  

    例  已知普鲁卡因Dmin=121.3mg/kg， Dmax=290mg/kg

   当n=6时，r=0.84,  各组剂量为：

1.  290 mg/kg

2.  290 mg/kg×0.84 = 243.6mg/kg

3.  290 mg/kg×0.84² = 204.6mg/kg

4.  290 mg/kg×0.84³ = 171.9mg/kg

5.  290 mg/kg×0.84⁴ = 144.4mg/kg

6.  290 mg/kg×0.84⁵ = 121.3mg/kg

   （2）药液配制

①药源充足时的配药方法

最高浓度药液（母液）的配制

   小鼠腹腔注射体积为0.2ml/10g= 20ml/kg，每组药液量为4ml左右，为留有余地，各组动物所需药液体积定为6ml。

   求出所需母液体积（V）及母液所需药量（M）

 V=各组动物所需药液体积 / (1-r)= 6 / (1-0.84)=37.5ml

 M = V  ´  Dmax/(20ml/kg)=37.5 ´ (290/kg) /(20ml/kg)=543.75mg

 各剂量组药液按下法稀释：

       543.75mg+生理盐水至37.5ml，混匀 → 第一组取6ml

                      ↓

                    31.5ml+生理盐水6ml，混匀 → 第二组取6ml

                          ↓

                        31.5ml+生理盐水6ml，混匀→ 第三组取6ml

                              ↓

                            31.5ml+生理盐水6ml，混匀 → 第四组取6ml

                                  ↓

                                31.5ml+生量盐水6ml，混匀 → 第五组取6ml

                                      ↓

                                    31.5ml+生理盐水6ml，混匀，为第六组药液

   ②药源紧张时的配药法

   各组所需母液的体积（ml）为：

母液总体积(V)=6  ´ (1+ r+ r² + r³ + r⁴ + r⁵ )

总药量(M)=母液总体积  ´ Dmax/（20ml/kg）

计算出V、M后，取药量M，用生理盐水稀释至Vml，用移液管精密吸取各组所需的母液量，加生理盐水稀释至6ml，即为各组试验药液。  

   3．动物分组：将小鼠雌、雄分开。分别称重，同一重量段（如 18.0―18.9g）小鼠放入一个笼内，标记小鼠。雌、雄小鼠分别按重量顺序分层随机分为6组，使不同性别和体重的小鼠能均匀分配于各组，每组10只。

   4．给药：各组动物分别腹腔注射相应浓度的药液0.2ml/10g，立即详细观察，记录动物反应情况、死亡时间和数目。在24h内作多次观察，以后每天观察1次以上，连续观察 7~14 天。按Bliss法及其它方法计算LD₅₀ 和95%可信限(由于Bliss法计算复杂，可用相关的软件进行处理)。  

  【结果】记录于表T1-1。

   【注意】

   (1) 随机性：实验中能控制的因素尽量使之均衡化，难以控制的因素也应力求严格随机化。分组时应先将不同性别分开，再将不同体重分开，然后随机分配，此法称为分层随机分组法。

   （2）剂量按几何级数排列，转换为对数后，剂间为等距，便于计算结果，估计误差。相邻高低剂量之比一般为1:0.6～1:0.85，剂距小，结果较精确，但过小易出现反应率颠倒的情况。剂距的大小也与给药途径有关，静脉给药时，剂距可偏小，灌胃给药时可适当偏大。

  （3）药物及给药途径应以静脉注射、腹腔注射和灌胃给药为主，选取的途径必须包括推荐临床给药途径。

  （4）LD₅₀ 受试验中多种因素的影响，如动物的品系、性别、年龄、饥饱以及环境因素中室温、湿度、光照、时辰（上、下午）等。当进行两药的毒性比较时，应尽可能在相同条件下进行，以减少抽样误差。

（5）在试验过程中应详细记动物的中毒症状及可能致死原因，必要时解剖死亡动物肉眼观察，如发现有组织病变时，可进行组织学检查，通常动物死亡多出现在给药后1～2日内，但全部试验应观察7日以上，如遇有迟发性或进行性中毒反应时，需根据实际情况延长观察时间。若发现中毒反应和死亡率对不同动物性别有明显差别，则应选择比较敏感的性别进行试验。  

（6）当药物毒性小，以最大浓度和最大体积给药后仍测不出致死毒性时，可测定最大耐受量： 即用临床试验的给药途径，以动物能耐受的最高浓度、最大容积的剂量1次或1日内连续  2 ～ 3 次给予动物（小白鼠至少20只，雌雄各半），连续观察7天，详细记录动物反应情况，以不产生死亡的最大剂量为最大耐受量。