毛细管区带电泳色谱仪的分离过程在缓冲液中进行,缓冲液的选择直接影响粒子的迁移和分离。
一、缓冲液的选择须遵循的要求:
1、在所选择的pH范围内有很好的缓冲容量。
2、在检测波长处无吸收或吸收值低。
3、为达到有效的进样和合适的电泳淌度,缓冲液pH值至少与被测组分的等电点相差l个pH单位。
4、自身淌度低,即分子大而荷电小,以减少电流的产生。
5、只要条件允许,尽可能采用酸性缓冲液。在低pH值下,吸附和电渗流都很小,毛细管涂层的寿命较长。
6、与毛细管种类匹配,涂层毛细管只能在一定pH范围内使用。
二、常用缓冲液:
常用缓冲液有硼砂、磷酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐和醋酸盐等。
三、缓冲液pH值:
1、缓冲液pH值的选择与样品性质有关。
(1)通常酸性组分选择在碱性条件下分离。
(2)通常碱性组分选择在酸性条件下分离。
(3)蛋白质、多肽和氨基酸等两性物质可选酸性(pH = 2)或碱性(pH>9)分离介质。
(4)糖类样品通常在pH = 9~11能获得zui优分离。
(5)羧酸或其它样品多在pH = 5~9选择分离条件。
2、缓冲液pH值的选择和毛细管种类有关。
很多涂层毛细管只能在一定pH范围内使用,如聚丙烯酰胺涂层毛细管只能在pH = 4~9使用,否则涂层易水解失效。
3、在相同pH下,不同缓冲液的分离效果可能相差很大。
一般来说,能与样品发生相互作用的试剂可能是zui好的。如分离糖类和DNA等分子时应优先使用硼酸盐缓冲液,因为硼酸根能与糖羟基形成配位键,增加糖的负电荷和分离度。硼酸盐缓冲液也适用于分离其它含邻羟基和多羟基的化合物。
4、为了选择合适的pH值,需要用pH调节剂调整介质的酸碱性。
由于多数缓冲试剂是酸性物质如磷酸,所以pH调节剂主要是碱类。常用pH调节剂有NaOH、KOH和Tris等。也可用胺和醇胺等有机碱如乙醇胺和乙二胺。如果缓冲试剂为碱类,可用酸作为调节剂,尽量使用弱酸如H3PO4。
缓冲试剂和调节剂的浓度对改善分离、抑制吸附和控制焦耳热等都有影响。一般缓冲试剂的浓度在10~200mmol/L,有时为了抑制蛋白质等的吸附作用,浓度可高达500mmol/L(此时应减少分离电压)。电导率大的缓冲试剂如磷酸盐和硼酸盐等的浓度一般在20mmol/L,电导率小的缓冲试剂如硼酸的浓度可在100mmol/L以上。