1、准备1mTU/HOBt溶液
1)配制0.5mol/LHOBt的DMF溶液：称量13.5g无水HOBt（相对分子质量135.1），置于250ml烧杯中，加入DMF至200ml。
2)配制0.45mol/LHBTU/HOBt溶液：将上述溶液倒人装有37.9gHBTU（0.1mM）的烧杯或烧瓶中。
3)利用磁力搅拌装置搅拌15min，直到HBTU完全溶解。
4)利用漏斗和滤纸对溶液进行过滤。
5)选择合适的容器收集滤液，备用（该溶液室温下稳定期至少为6周）。
2、氨基基团与生物素结合
1)用DMF洗涤0.1mmol树脂。
2)将0.244g生物素溶解于5ml的DMF-DMSO（体积比1：1）溶液中，可以适当加热以加速溶解。
3)在上述溶液中加入2.1ml0.45mol/LHBTU/HOBt溶液和0.3mlDIEA。
4)将活化生物素溶液加入柱子中，旋转过夜。
5)进行二氢茚三酮测试（无色），确认生物素已经与柱子结合。
6)用2XDMF-DMSO（1：1）溶液洗涤柱子，去除多余的生物素
7)依次用2XDMF和2XDCM洗涤柱子。
8)肽段脱离之前，柱子要进行干燥。
3、将Fmoc氨基酸装入2-ChlorotritylChloride柱中
1)用反应管道称量log 2-ChlorotritylChloride树脂（15mmol），用2XDMF洗涤后，在50ml的DMF中浸泡10min，排尽管道中的液体。
2)用试管称量10mmolFmoc氨基酸，用40mlDMF进行溶解，将溶液转移至上述反应管道中，加入8.7mlDIEA（50mmol），室温下涡旋30min。
3)再向反应管道中加入5ml甲醇，涡旋5min。
4)排尽管道后用5XDMF洗涤。
5)检查替代率。
6)加入50ml20%六氢吡啶，去除Fmoc基团，涡旋30min。
7)依次用5XDMF和2XDCM洗涤后，将树脂放置于泡沫板上的薄纸上，于室温下干燥过夜。将另一张薄纸覆盖在树脂上，轻轻挤压，以破碎聚集物。
8)对树脂进行称重，并装入合适的容器内备用。
4．检查含有Fmoc氨基酸树脂的替代率
1)用微量离心管称量双份5～10mg含Fmoc氨基酸树脂样品，加1.00ml20%六氢吡啶/DMF，振荡20min后，离心使树脂沉降。
2)将100ul上清液转移至装有10mlDMF的试管中，混合均匀。
3)用移液管分别转移2mlDMF到参比杯和样品杯中，将分光光度计调零，利用参比杯调空白后，向样品杯中加入2ml步骤2)中所得溶液，读取光吸收值。
4)利用下列公式进行替代率（Subs）的计算： Subs＝101（A）/7.8（w），式中：A＝光吸收值；w＝树脂的质量（mg）。
5)在301nm处测试光吸收值3次，计算平均替代率。
5、Fmoc合成的步骤
1)用4XDMF洗涤树脂后排尽液体。
2)向树脂中加入约10ml20%六氢吡啶/DMF，振荡1min后排尽。
3)再加入10ml20%六氢吡啶/DMF，振荡30min。
4)排尽液体后再用4XDMF洗涤树脂，确保没有六氢吡啶残留。用二氢茚三酮测试进行检验，树脂颗粒应该显蓝色。将1mmolFmoc氨基酸、2.1ml0.45molHB-TU/HOBT（1mmol）、348glDIEA（2mmol）加入树脂中，振荡不少于30min。
5)排尽液体后用4XDMF洗涤树脂。
6)进行二氢茚三酮测试，若为无色，从步骤2)开始重新合成；若为蓝色，回到步骤5)与Fmoc氨基酸重新结合，如有需要，可增加这一步的反应时间。
6、用Fmoc-磷酰酪氨酸合成含磷酰酪氨酸的肽段
所需试剂：Na-Fmoc-O-磷酰酪氨酸1g。
1)若用ABI多肽合成仪进行0.1mmol或0.25mmol的合成，使用0.483gFmoc-Tyr（PO3H2）-OH（1mmol）即可，将Fmoc-Tyr（PO3H2）-OH装好备用。
2)结合Fmoc-Tyr（PO3H2）-OH的步骤与其他Fmoc氨基酸结合步骤，除了结合时间（见下一步）以外，基本相同（注意：ABI多肽合成仪利用HBTU/HOBT作为催化剂）。
3)需要增加Fmoc-Tyr（PO3H2）-OH的结合时间。例如，ABI公司的合成仪430A加入了较多步骤，如有必要可以进行过夜反应。
4)完成Fmoc-Tyr（PO3H2）-OH结合后，进行二氢茚三酮测试，若无色，说明结合完全，若显蓝色，说明尚未完全结合。
5)在磷酰酪氨酸结合后或进行同步结合时，要增加氨基酸残基的反应时间（注意：在磷酰酪氨酸结合后进行氨基酸残基结合比较困难）。
6)由于磷酸基团未被保护，很有可能发生侧链反应，因此在磷酰酪氨酸上结合的氨基酸数目是有限制的（注意：磷酰酪氨酸上结合10个氨基酸的多肽已经成功合成）。
7、被保护肽段的脱离
原始树脂：Chlorotrityl树脂；lg含肽段树脂所需试剂：1ml乙酸（AcOH）：2ml。
1)准备上述试剂的混合溶液。
2)将含肽段树脂加入上述溶液中，室温下搅拌1h。
3)过滤，并用2X10mlTFE：DCM（2：8)）混合溶液洗涤树脂，确保所有产物复性。
4)蒸发溶液使得液体体积少于5ml。
5)向含有10ul上述溶液的试管中加入醚，观察被保护肽段在醚中的溶解性。若有沉淀，进行步骤6)若没有沉淀，进行步骤7)。
6)向步骤4)的溶液中加人冷却的醚，使得被保护的肽段完全沉淀。进行过滤可获得多肽产品。
7)一些被保护的肽段在醚中溶解，这种情况下需要加水使其沉淀，进行过滤即可获得产品。
8、固相结合的Fmoe-lys（Mtt）的Mtt基团脱除
所需试剂：Fmoc-Lys（Mtt）-OH1g。
1)在DCM中浸泡树脂使其膨胀。
2)用2X3%TFA/DCM洗涤树脂（由于树脂已经在DCM中膨胀，这一步用3%TFA/DCM快速洗涤确保了TFA的浓度精确为3%）。
3)在3%TFA中振荡树脂10min。
4)重复步骤3)。
5)依次用3XDCM、3XDMF、3X异丙醇、3XDCM洗涤树脂。
6)将树脂在空气中干燥。
9、肽段的FITC标记
所需试剂：FITC1g，Fmoc-Ahx-OH1g。
1)在标准结合条件下将Fmoc-Ahx-OH与肽段的氨基酸N端结合。
2)用20%六氢吡啶脱去Fmoc基团。
3)用3XDMF或4XDMF洗涤树脂。
4)将树脂浸泡在DCM中使其膨胀，而后排尽液体。
5)配制FITC的吡啶/DMF/DCM（12：5：7）溶液。向树脂中加入足够的溶液制成悬浮液。注意溶液的用量，因为反应的速率与悬浮液的浓度成正比。
6)加人步骤2)中所得溶液。
7)过夜混合。
8)利用二氢茚三酮反应检测反应是否进行完全。若FITC与氨基未完全结合，反应显蓝色，需要重新进行步骤5)～7)。
9)依次用2XDMF、2X异丙醇、2XDCM洗涤树脂。
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