猪组织和尿液中环庚啶和可乐定残留量的高效液相色谱...

猪组织和尿液中环庚啶和可乐定残留量的高效液相色谱法检测

一、原理

用酸性乙腈提取组织样品中的赛庚啶或可乐定，用高效液相色谱-质谱法测定，内标法定量。用高效液相色谱-串联质谱法测定尿液中残留的西普那定或可乐定，并用内标法定量。

二、试剂和材料

2.1 试剂

2.1.1甲醇（CH3OH）：色谱纯。

2.1.2CH3CN)：色谱纯。

2.1.3甲酸（HCOOH）：色谱纯。

2.1.4氨(NH4OH)

2.1.5 盐酸（HCl）。

2.1.6 硫酸镁（Mg 2 SO4）。

2.1.7 氯化钠（NaCl）。

2.2 溶液配制

2.2.1 1 1 mol/L盐酸溶液：取90 ml盐酸，用水稀释至1000 ml。

2.2.2 1%甲酸乙腈溶液：5mL甲酸稀释至500 mL乙腈

2.2.3 0.1%甲酸溶液：取1毫升甲酸，用水稀释至1000毫升。

乙腈-0.1%甲酸溶液：80mL0.1%甲酸溶液，加入乙腈至100mL，混匀。

2.2.5 5%氨水甲醇溶液：取氨水5ml，用甲醇稀释至100ml。

2.3 标准品

2.3.1盐酸赛庚啶、盐酸可乐定：含量≥98.0%。

2.3.2内标：盐酸二苯胺盐酸可乐定d 4：含量≥98%。

2.4 标准溶液制备

2.4.1标准储备液(1mg/mL)：盐酸赛庚啶、盐酸可乐定、二苯拉林盐酸和盐酸可乐定-D_4标准品分别在10 mL瓶中溶解，用甲醇稀释成比例，制得盐酸赛庚啶、盐酸可乐定和盐酸可乐定标准溶液，其浓度分别为1mg/mL。在10 mL瓶中制备了盐酸赛庚啶、盐酸可乐定和盐酸可乐定的标准品。4℃保存6个月。

2.4.2混合标准工作液（10μg/mL）：用10％g/ml的盐酸西普那定盐酸和可乐定盐酸标准工作溶液在100ml瓶中分别制备Cyan庚定盐酸和可乐定盐酸标准工作液，分别用甲醇溶解并稀释至刻度。制备了盐酸西普那定盐酸和盐酸可乐定盐酸的标准工作液。制备了盐酸西普那定盐酸和盐酸可乐定盐酸的标准工作液。4℃保存3个月。

2.4.3混合内标中间溶液：获得100％L二苯胺盐酸储备溶液，1ml可乐定盐酸D4储备溶液用甲醇稀释，制备含有1％g/ml盐酸和410％g/ml可乐定盐酸的混合内标中间溶液，在100ml烧瓶中，制备含有二苯胺盐酸1,g/ml,可乐定盐酸-D410,g/ml的混合内标中间溶液。4℃保存1个月。

2.4.4混合内标工作液：将混合内标中间液1mL装于10 mL瓶中用乙腈-0.1%甲酸溶液稀释成规模化制备含盐酸二苯拉林100 ng/mL和盐酸可乐定41μg/mL的混合内标工作液。

2.4.5标准曲线的制备：精密量取适量的混合标准工作液和混合内标工作液，用乙腈-0.1%甲酸溶液稀释成一系列浓度为0.5、1、10、50、100μg/L的赛庚啶和可乐定混合标准工作液其中盐酸二苯胺和盐酸可乐定d 4的浓度分别为5μg/l和50μg/l。

2.5 材料

2.5.1C18粉末：碳负荷25.0≤28.0。

2.5.2混合强阳离子固相萃取柱60mg/3ml或等效物。

2.5.3滤膜：0.22μm，水相。

三、仪器和设备

3.1高效液相色谱串联质谱仪,分布喷雾电离源。

3.2分析平衡：灵敏度0.000 g，0.01g·L-1·L-1。

3.3 均质机。

3.4冷冻离心机,8000 r/min以上。

3.5 涡旋振荡器。

3.6 氮吹仪。

3.7 固相萃取装置。

3.8 pH 计。

3.9离心管,50 mL。

四、试样的制备

4.1 试料的制备

4.1.1 猪肌肉、肝脏、肾脏

取适量新鲜或解冻的空白或试验组织，研磨均匀。

以均质样品为试验材料。

取均质空白试样作为空白试样。

以均质空白样品,加入合适的浓度标准工作液作为空白添加材料。

4.1.2 猪尿样

取适量新鲜或解冻的空白或试验猪尿恢复至室温后使用混匀如有浑浊离心，取上清液备用。

以备用测试样本作为测试材料。

以备用空白样品为空白材料。

以备用空白样品加入合适的浓度标准工作液作为空白添加材料。

五、测定步骤

5.1 提取

5.1.1 组织样品

取供试品2g（精确至±20mg），置50ml离心管中，加入50μl混合内标工作液，猪肌肉样品加入0.5g C18粉末，肝肾样品加入3.0g硫酸镁和2.0g氯化钠，摇匀，加入1%甲酸乙腈10ml，摇匀，离心至8000r/min，5min，取上清液，用离心管在50℃水浴中用氮气吹干。甲醇-0.1%甲酸溶液以1.0mL溶解，用0.22μm滤膜过滤，用高效液相色谱法(HPLC)和串联质谱法(MS)测定。

5.1.2 尿样

取供试品5.0ml，置50ml离心管中，加入50μl混匀内标工作液，用1mol/L盐酸调节pH值小于2，旋涡搅拌均匀，在4℃下8000 r/min离心10min，上清液移入另一50ml离心管备用。

5.2 净化

尿液样品：固相萃取柱，甲醇，水3mL活化。将所有备用溶液通过色谱柱，依次用3毫升0.1%甲酸溶液和3毫升甲醇洗涤，干燥2分钟，用3毫升5%氨水甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，用氮气在50℃水浴中干燥，用1.0毫升乙腈-0.1%甲酸溶液溶解，过滤0.22μm滤膜，hplc-ms串联测定。

5.3 测定

5.3.1 色谱条件

色谱柱：C18(100 mm×2.1 mm，1.8μm)；

b柱温：30℃；

c进样量：10  L；

d流速：0.3 mL/min；

e流动相：A:乙腈；B:0.1%甲酸溶液梯度洗脱程序

5.3.2 质谱条件

a离子源：电喷雾离子源；

b扫描方式：正离子扫描；

c检测方式：多反应监测；

d离子源温度：150℃；

e脱溶剂温度：500℃；

f毛细管电压：3.0 V；

g关于定性离子对，定量离子对锥电压和碰撞能

5.4 测定法

5.4.1 定性测定

在相同的试验条件下，赛庚啶和可乐定在样品溶液中的保留时间与标准工作溶液中相应的保留时间之比在±5%以内。测定离子的相对丰度应与同浓度校正标准溶液的相对丰度一致允许偏差应符合表3的要求。

5.4.2 定量测定

取样品溶液和标准溶液进行单点校准按内标法定量标准溶液和样品溶液中化合物组分和内部标准的响应值应在仪器检测的线性范围内在上述条件下，赛庚啶、可乐定和内标液的色谱图

六、结果计算和表述

根据公式计算样品中有待测定的药物残留量：

式中：

样品中赛庚啶或可乐定的残留量单位为微克每千克（μg/kg）或微克每升（μg/L）；

样品溶液中赛庚啶或可乐定的内标浓度为微克/升(μg·L)。

混合标准工作液中赛庚啶或可乐定的浓度，单位为μg/L；

混合标准溶液中赛庚啶或可乐定的内标浓度为微克/升(μg·L)。

赛庚啶或可乐定在样品溶液中的峰面积；

赛庚啶或可乐定在样品溶液中与内标物对应的峰面积；

赛庚啶或可乐定混合标准工作液的峰面积；

赛庚啶或可乐定的峰面积与混合标准溶液中的内标相对应。

用于溶解残留物的溶液体积单位为毫升（ml）；

供试样品质量，单位为克（g）。

供试尿样体积，单位为毫升（mL）