本文对苹果酒中有机酸的高效液相色谱(HPLC)进行了系统的研究优化了色谱柱型、流动相、流速、检测波长等色谱条件。
1、实验材料
实验室制苹果酒样品；L苹果酸（色谱纯度）；L乳酸（色谱纯度）；L苹果酸（分析纯度）；甲醇（色谱纯度）；甲酸（色谱纯度）。
2、实验仪器
分析天平0.1mg；
漩涡混合器 ；
数控超声波清洗器 ；
循环式多用真空泵 ；
高效液相色谱仪 ，配紫外检测器 ；
pH计 。
3、样品预处理
苹果酒样品室温平衡后用滤纸过滤然后用0.45um微孔滤膜过滤稀释3.3倍，直接注入。
4、仪器及其条件
色谱柱：C18 （3.5um X4.6mm ×75mm ）；
柱温：25℃ ；
流动相为甲酸0.1%＋3%甲醇，在使用前用0.45μm混合纤维膜进行真空过滤。
流速 ：0.5mL／min ；
进样量 ：20ul；
检测波长：210nm 。
有机酸的表征：将苹果提取液的色谱图与苹果酸和乳酸的标准色谱图进行比较。根据保留时间对苹果酒中有机酸的种类进行了初步确定，并加入样品外标法和谱图数据进行了辅助定性分析。
有机酸的定量测定：制备L-苹果酸和L-乳酸的混合标准溶液，并稀释至6种浓度（苹果酸5000, 4000, 3000、2000, 1000和500 mg/L、乳酸2000, 1500, 1000、500, 200和100 mg/L）。
根据高效液相色谱(HPLC)的分析条件，对每种浓度梯度的混合标准样品进行测试。在每个水平点重复进样三次。将质量浓度(X，mg，L)与峰面积(Y)作图，绘制标准曲线。
5、色谱柱的选择
在苹果酒中有机酸的高效液相色谱检测中，优化有机酸的色谱分离条件，包括色谱柱类型、流动相比、流速、检测波长等。
液相色谱柱是高效液相色谱分离系统，对混合物中各组分的准确定性和定量分析起着重要作用。为了使苹果酒对高效液相色谱有较好的分离效果，首先对色谱柱进行了优化。
本实验选 用了3 种型号的柱子 ，即
①C18柱 ，5um ×4.6mm× 250mm ；
② T3柱，5um × 4.6mm ×250mm；
③ C18柱，3.5um ×4.6mm ×75mm 。
以苹果酸和乳酸混合标准样品和自制苹果酒为研究对象，对三柱的分离效率进行了研究。在相同的洗脱条件下对色谱图进行了测试，t3柱在同一分析时间内分离效果较好。考虑到相似的分离效果，c18柱可以在最短的时间内使用。苹果酸和乳酸可有效分离，样品仅需12分钟即可分析。这是因为C18柱(3.5μm/4.6mm或75mm)是快速分离柱。柱的粒径小于普通柱的粒径，为3.5μm。与传统的高效液相色谱相比，快速分离柱高效液相色谱具有分离时间短、分析速度快、流动相消耗少分析成本低等优点为了高效完成试验工作，本研究在各峰分离效果良好的前提下，尽可能缩短所需的分离时间，因此我们最终选择C18（3.5um×4.6mm×75mm）柱作为实验的分析柱..
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