当需要以纳米级分辨率观察样品超微结构时，科学家通常借助电子显微镜（观察表面结构的扫描电镜 SEM 和观察内部结构的透射电镜 TEM）——它们是当前科研界可使用的最大显微成像工具。

电镜成像要求对样品进行通常 20-150 nm的超薄切片，使用超薄切片机切割的切片厚度薄、表面平整、光滑且无人为干扰因素，因此可以满足电镜成像对制备样品的严苛要求。如果大量超薄切片具有样品结构的前后连续性，SEM 成像采集的图像就可以进行样品内部结构的 3D 重建，形成可用于分析的完整超微、精细立体图像，即连续断层成像技术（Array Tomography, AT）。

今天，小编简要介绍一下AT成功的关键环节：连续超薄切片样品制备。

超薄切片之重要性

AT 常用于细胞、蛋白质等生物 / 生物大分子结构的纳米分辨率、3D 结构观察和分析，主要步骤为包埋样品连续（超薄）切片、TEM / SEM 或光学显微镜对其进行成像、对获得的一系列图像进行重建分析。AT 可以获得的有效信息包括超微结构的定量、体积分析和细胞 / 蛋白的形态学数据等，相较于共聚焦显微镜获得的图像，具有更高的水平和空间分辨率（可达 0.2 nm）。

超薄切片主要用于 TEM 成像前的样品制备，以纳米分辨率观察样品内部结构信息。无污染且获取快速的超薄切片的主要优势在于：

• 整个切片均可用于电镜成像，适合大尺寸样品分析；

• 单张切片电子透射均一性好，保证结果可靠性；

• 制备速度快，短时间即可获得大量切片；

• 适用样品范围广，生物样本和工业材料均适用。

超薄切片的基本原理

对于 TEM 或者 3D 结构重建，样品高质量连续切片是前提。因此，一台如 Leica EM UC7 或者 EM ARTOS 3D（20-50 nm）（见图 1）一样稳定可靠的超薄切片机是开展实验的必备工具。

样品被安装在可上下前后精准移动的电动机械臂上，机械臂垂直上下移动、遇到固定的玻璃刀或钻石刀时，第一条样品带被切下（图 2），然后刀台自动向左移动，按照设定的切片厚度完成第二条切割。同理，随后刀台再向左移动，完成第三条切割（图 3）。从刀片上直接取下切片是十分困难的，因为它非常薄且脆弱，徕卡超薄切片机采用温和水流托举的方式使条带不断分离，能够保证条带质量不被破坏同时操作极其简单（冷冻切片情况可借助显微操作），然后进行上电镜前的其它必要处理。

▲ 图 2. EM ARTOS 3D 超薄切片机样品切割位置基本结构

 

• ▲ 图 3. EM ARTOS 3D 制备的连续超薄切片条带

        连续断层成像的样品制备
   

  多数未处理的生物样品比较柔软，AT 成像前的样品制备主要包括下面几个步骤：

• 组织固定

• 样品水分抽提和包埋

• 连续切片和切片条带收集

• 切片染色以用于成像（如果需要）

• 最后使用 SEM 或光学显微镜（通常荧光成像情况）对结构上具有连续性的切片进行成像，合成图像以进行 3D 重建和分析。
  

• 对于市面上多数超薄切片机，使用者在 AT 成像的样品制备时，通常会发现这是一项耗时耗力、中间一些操作必须手工完成的工作。EM ARTOS 3D 是 Leica 2019 年新推出的高端 3D 连续超薄切片机，能够自动化连续切片、显著缩短样品制备时间、减少人工操作、切片无褶皱、厚度均一、温和水流取条带、提高样品制备成功率等众多优点，在向下兼容普通超薄切片需要的同时，特别合适高通量切片和 AT 等前沿研究对样品制备的严苛要求（视频 1）。

  数据展示
  

  ▲ 图 4. AT 技术获得的鼠淋巴结 3D 结构重建

  来自：Science and Technology (IST) Austria, Klosterneuburg
   

  相关文献：

  1. Variety of RNAs in Peripheral Blood Cells, Plasma, and Plasma Fractions

  2. High Resolution Array Tomography with Automated Serial Sectioning

  3. 3-Dimensional Imaging of Macroscopic Defects in Aluminum Alloys