蓝藻的生物毒性研究

图1. 实验室条件下进行蓝藻的培养。

由蓝绿藻类原核生物所产生的具有生物活性的次级物质，日渐成为制药业感兴趣的原料，但与此同时，其潜在的生物毒性可能对环境和食品产生危害，关于它们的鉴定工作亦非轻而易举之事。

蓝绿藻类原核生物（通常亦称蓝藻）指的是具有光合活性的细菌，主要生长于海洋和淡水中，有时也生长在地表和粮食上。这些藻类和绿色植物一样，能够进行光合反应，而且还具有“天线复合体”的功能，可吸收500~600 nm的波长光，因此蓝藻通常显淡蓝色或淡红色。当蓝藻的特定种类突然间以爆炸性的方式大量繁殖时（亦称为“水华”），我们才会引起重视，这种现象通常会导致水体质量的严重下降，妨碍相关水体资源的利用。

蓝藻可产生带有强烈毒性的生物活性物质，这种剧毒化合物被称为藻毒（Algentoxine或Cyanotoxine），具有广泛的毒性。在大多数情况下，这些毒素在海藻细胞破裂或死亡时被释放出来，有时也由这些细胞主动分泌。已知的毒性化合物有微囊藻素（一种大分子环状肽类）、β-甲氨基丙氨酸、蓝藻毒素（CYN）、类毒素-A和河鲀毒素等（见图2）。

人类中毒的情况常源于在受污染的水域中洗浴，饮水和食用贝类、鱼类等食物。然而迄今为止，关于蓝藻毒素以及真核藻毒的分析和毒物学研究尚未引起足够的关注。在欧洲食品安全局（EFSA）、联邦德国风险评估研究所（BfR）、德国科学研究协会（DFG）健康无害性食品评议委员会（SKLM）以及美国环境保护局（EPA）的文告中，均提出需要采取紧急对策，以防止高风险毒素的出现。

图2. 若干重要藻毒素的结构，A：类毒素-A；B：柱孢毒素；C：石房蛤毒素；D：β-甲氨基丙氨酸。

藻毒素研究的启动

产生毒素的蓝藻大多起源于热带水域，历史记载了很多由于接触了受污染水域而引起的中毒事件。特别值得一提的是，由于气候变异，许多新的细菌种类可能也迁徙到了欧洲水域，对这些区域的食物和饮水带来了新的危险。

一份关于德国内陆水域取样调查研究报告显示，22%的水样发现了藻毒素，如类毒素-A和蓝藻毒素（CYN）。在德国的许多水域中，CYN的浓度达到了12.1μg/L，而澳大利亚部分水域还高达500μg/L。

迄今为止，对这种细菌生物活性次级代谢物的谱图研究，远远不如对已知毒素那样充分。此外，关于这些化合物在人和动物体内的吸收、分配以及代谢机理的研究数据几乎是空白。鉴于信息的匮乏，德国联邦材料研究所（BMA）以双倍投入启动了这项研究工作：

采用活性导入分析法，为进行理学研究和药物研究制备标准物质，对新的目标结构进行鉴定；

确保分析工作的安全可靠性，鉴定新的人体暴露途径。

有关分析可划分为以下5个方面。

图3. 采用HPLC-UV-MS 和MS/MS分析含10%的丝囊藻属细菌的甲醇萃取物的谱图。A：脱氧CYN 的MS/MS 质谱图（m/z: 400.1 à 194.1）；B；CYN 的MS/MS 质谱图（m/z：416.1 à 194.1）；C：全扫描质谱图；D：位于254 nm时的UV 信号峰。

实验室培养

一套蓝藻系列物质已于日前从自然界分离出来并进行了生物特征鉴定，但从中得到的生物活性化合物谱图还未进行研究，即使近亲种类也未完成。因此针对蓝藻的风险和评估研究第一步，就是在实验室规模上进行培养和分离（见图1）。这里涉及的大多数种类都是可以在含盐和维生素的介质中培养。为了保证具有光合作用活性的蓝藻的生长，有必要在调节昼夜的情况下提供充足的光照和通风。

介质与细胞材料

在生物活性次级代谢研究中，将其分为两类，一是由活细菌释放出来的（如CYN），二是细菌死亡后所释放出来的物质（如微囊藻素或脂多糖）。毒素的释放研究对于其风险评估和利用具有重要意义。借助于离心（在流通型离心机中）和过滤装置将介质和细胞材料分离后，就可进行进一步研究。将细胞进行冷冻干燥，分解后再进行萃取。

图4. 采用大型蚤在暴露于纯CYN溶液（20?μmol）时的活性实验，与以一种具有相同CYN浓度的蓝藻总萃取物进行对比。

萃取与分步收集

不仅是蓝藻的萃取物还是介质的残留物，均为复杂的混合物，几乎无法对其整体进行分析。例如CYN虽然能通过蓝藻萃取物的总离子谱图中（TIC）进行辨认，但其衍生物脱氧CYN则无法检出，后者的紫外谱图呈现的是迄今为止研究尚少的谱峰（见图3）。

假如要对萃取物每个组分的效应进行研究，就必须对混合物进行预先分离。这里需要应用基于固相萃取、GPC以及制备型HPLC的正向分离技术。借助于这种方式可以将总萃取物按照不同的属性（例如分子大小、极性、功能）加以分离。这些易于分析的馏分遂按其生物活性进行不同的检测，继而将其进一步分离成单个化合物，按照生物效应排序。

生物模型系统

为了研究目标化合物或混合物的生物活性，应用了多种具有专属性的检测系统，以观测到专属的生物效应，接着便采用酶分析法或基于细胞培养的方法。第一步，采用非专属性的检测，聚焦于“一般性毒素”的作用。在对蓝藻萃取物进行研究时，不仅应用了水蚤（对介质中毒素具有高敏感性的小甲壳类），还应用了芥末种子（随机确定的模型植物，用来研究对植物生长产生一般性影响的因素）。BAM所进行的水蚤实验表明：萃取物和一种具有相同主体毒素CYN含量的纯溶液显示出各不相同的毒性（见图4）。可以看出，由调节至20μmol CYN浓度的总萃取物所显示出的毒性较之于纯物质要大很多。通过对萃取物进行了进一步的分馏，以探查那些可能的和迄今尚未研究过的毒素或者毒素的协同效应。 例如日前从芥末实验中经用毛细管电泳分离出来的细菌萃取物，就显示出微囊藻素的植物毒性。

分离与纯化

如果一种感兴趣的化合物/一种毒素得到确定，就必须最后将其纯化，进行专属的毒物学检测，或者开发灵敏的分析方法。为此进行了带培养的放大实验，进一步细化了萃取和纯化工艺。此外还为进行LC-MS/MS 分析应用了以同位素标记了的类似物用作内标。通过化学和生物的合成实验，制造出这些物质。借助于鉴定、纯化以及毒物学特征确证，方能允许做出风险评价和潜在的生物化学化合物方面的评估。例如根据在老鼠中所做的不同研究，发现毒素CYN实际的毒性（LD50为0.2~2 mg/kg体重），比如肝毒性和致癌性，以及在慢性摄入时会引起红血球降低。这些效应大部分可归结于对谷胱甘肽以及肽的生物合成的抑制作用，而通过代谢的激活作用被进一步强化。

由于这些毒物学上的重要性，还有必要研究人类在暴露于CYN时的风险，如直接接触受蓝藻污染的水体，接触水族营养物例如采用受污染的水进行灌溉的植物类等。但目前对于CYN以及其它藻毒素而言，既没有可靠的分析方法，也没有适当的内标物质可供使用。

新的研究领域急待开启

藻毒由于具有高含量的生物活性物质，一方面隐藏着许多迄今为止不为人知的风险，另一方面也隐藏着巨大的潜在应用可能性。借助于简单的生物活性模型系统，可以揭示这些物质的潜在能力，如对无脊椎动物的毒性/植物再吸收可能性。对这些天然物质进行鉴定和制备性纯化是深入研究的基本前提，高效率的色谱分离技术和相分离也是正在开启的新研究领域。从非特殊性毒素的检验入手，是对生物活性结构解析而言最基本的工作。对于食品中藻类毒素含量，相关的政策性规定很少，迄今为止仅见世界卫生组织（WHO）颁布了关于饮用水中微囊藻毒素-LR临时性指导值1?μg/L，而关于其对动植物性暴露途径的研究依然太少。总之，在生物活性的次级代谢领域，分析学和毒物学仍有很多工作需要开展。

关于藻毒素的验证

如同许多生物样品一样，藻毒素的基体也是非常复杂的，对其的样品前处理诸如离心、过滤、冷冻干燥以及萃取费时费力。萃取物通过色谱分离工艺如固相萃取、凝胶色谱（GPC）以及制备HPLC进行进一步的分馏，继而对分馏部分进行生物活性测定。理想的方法是采用以同位素标记的内标物质，借助LC-MS/MS分析，对离析出来的目标化合物进行定量测定。