对于药物研发公司来说，尽可能早地掌握药物研发过程中候选药物代谢过程的具体信息是至关重要的。质谱已经成为用于药物代谢研究中的一个关键性分析工具，使药物的代谢物鉴定更快更精确。
对一个药物研发公司来说，尽可能早地掌握药物研发过程中候选药物代谢过程的具体信息是至关重要的。它可以节省时间、资源，以及将投资收益率最大化。成功的候选药物的最后选择，很大程度上依赖于体内和体外的药物代谢研究。
质谱是药物代谢研究中用到的一个关键性分析工具，因为它可以识别代谢物，确定代谢发生的位点。液相色谱与质谱联用（LC-MS/MS）法因为灵敏度高和分析复杂混合物的能力，已经成为代谢鉴定的特别技术。但是，目前在非常复杂的生物基质存在的情形下检测和鉴定代谢物仍然是一种挑战。
质谱的硬件和软件上的新发展正在帮助解决这种挑战。例如，将OrbitrapTM质量分析器串联到线性离子阱质谱上，就可以简化代谢鉴定过程，使之更快，更灵敏，更精确（分辨率超过100K，质量精度大于3ppm），并且可以揭示丰富的结构信息。有了高分辨和精确的质量数据后，研究人员可以从背景的基质离子中解决和识别代谢物的峰。新的数据处理技术，比如质量亏损过滤，可以用于去除基质相关的大量的背景离子，缩小假阳性的数目，提供更可信的结果。
本文介绍了如何将创新性的质谱和质量亏损过渡软件相结合，使代谢物鉴定更快更精确。
质量亏损过滤技术
高分辨质谱能够应用数据采集后的数据精炼技术，其中之一就是质量亏损过滤（MDF），该技术可净化代谢物谱图和过滤大量的背景离子，从而改善信噪比。
“质量亏损”指的是一个元素（或者一个化合物）的精确质量数和它最接近的整数值（见表1）之间的差异，代谢物的质量亏损通常位于相当窄的范围内。基于母体药物的分子量，研究人员可以估计这些代谢物的分子量范围和质量亏损落在什么区间。质量亏损过滤用于排除落在期望的范围之外的所有离子。
数据缩减技术允许用户单单注意潜在的候选药物代谢物分析，它是用高分辨质量数据获得小的更精炼的数据集的强大而精细的方式之一。这种方法也可以扩展于多重质量亏损过滤（MMDFs），即在一个相对较宽的质量亏损范围内用几个过滤器来鉴定感兴趣的代谢物。
用质谱鉴定代谢物
代谢物鉴定通过将多重质量亏损过滤应用于LTQ Orbitrap XL组合质谱仪的数据收集过程来执行。该质谱仪的特点是执行高能碰撞解离（HCD）进行裂解反应的碰撞室。高能碰撞解离能够提供线性离子阱中碰撞诱导解离之外的辅助裂解算途径。离子离开C-trap后被加速，然后在充满氮气的HCD碰撞室裂解。因此而产生的碎片返回到C-trap，然后在仪器的质量分析器中被检测。这个技术产生丰富的“类似三重四极杆”裂解方式，包括对说明代谢物结构非常有用的低m/z质量范围的碎片。
案例解析
本文以伊立替康为例使用质谱进行代谢物鉴定。用老鼠的肝脏细胞孵育伊立替康样品，再用带高能碰撞解离功能的LTQ Orbitrap XL仪器分析。收集潜在代谢物的碰撞诱导解离（CID）和高能碰撞诱导质谱图，并且用多重质量亏损过滤处理原始数据。
图2. 老鼠肝细胞孵育10mM伊立替康的基峰色谱图：（a）原始的；（b）单次质量亏损过滤；（c）多重质量亏损过滤（MMDF）。
用一个雄性老鼠和一个雌性老鼠混合的肝细胞进行孵育实验，细胞密度为50万个/ml，伊立替康在最终1ml的孵育液中的浓度为10μM。溶液震摇过夜，用干冰淬灭，然后加入200μl冷冻的乙腈，将溶液涡旋混合，离心。从1ml上清液中取出10μl，进LC-MS/MS系统进行分析。
实验仪器
高效液相色谱: Thermo Scientific Accela高速液相；
色谱柱: Thermo Scientific Hypersil GOLD，1×100 mm, 1.9μm粒径；
质谱仪：Thermo Scientific LTQ Orbitrap XL，带HCD碰撞室。
实验结果
使用高能碰撞解离和碰撞诱导解离的同时，结合使用多重质量亏损过滤，可以从孵育样品中鉴别15种伊立替康代谢物，精确度优于3ppm（表1）。所有的15种代谢物的峰面积均小于母体化合物的1%，并且隐藏在原始的色谱图中（图2a）。 应用单次质量亏损过滤后，丰度最高的代谢物的峰变成可见了（图2b）。然而，目前跟代谢物无关的背景基质离子产生的峰仍然很突出。这是为了仅仅使用一次质量亏损过滤来俘获所有的代谢物，使用了相对较宽的质量亏损范围。因此，一部分背景离子在单次质量亏损过滤后仍然会残留下来。
接下来，四个不同的质量亏损过滤器用Thermo Scientific MetWorks软件包应用原始数据中。这个软件包可同时应用六个质量亏损过滤器。处理后的色谱图更干净（图2c）。
图3进一步阐明了质量亏损过滤后全扫描质谱图如何变化的。m/z 603.2805的峰是在8.45min流出的一个羟基化代谢产物（M3）。在原始的全扫描质谱图中，背景离子占绝对优势，M3仅仅只有小于15%的相对丰度（图3a）。经过单次质量亏损过滤后，M3峰变成了基峰。然而，仍然有许多背景峰残存在谱图中（图3b）。经过多重质量亏损过滤后，谱图中仅有M3峰和痕量的母峰存在，与此同时，几乎所有的背景离子消失了（图3c）。
结论
高能碰撞解离和碰撞诱导解离可结合使用提供了全面的裂解信息。多重质量亏损过滤提供了比单次质量亏损过滤更高的背景鉴别能力，可鉴别出峰面积小于母体药物峰面积1%的代谢物峰。
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