MIDASTM确证Biomarker（一）

2020.3.08

王辉

致力于为分析测试行业奉献终身

生物标志物的发现是一个复杂而漫长的过程，AB公司结合QTRAP系列质谱系统的独特功能与扫描模式，创造性地开发出MIDASTM（MRM Initiated Detection And Sequencing）工作流程，满足了生物标志物验证与确认的4S要点，可以准确、快速、简便地完成大样本量的生物标志物验证与确认工作。本文结合实际的应用案例介绍了这一技术。

生物标志物（Biomarker）的发现是一个复杂而漫长的过程。在此研究过程中可能会面临各种困难与挑战。其一，蛋白质类生物标志物在体内变化不大，难于检测。通常不是有和无的变化，而仅是体内浓度发生相应改变，这种变化量基本上都小于10倍，通常在5倍变化量之内；其二，个体之间，甚至于同一个体的不同批次样本之间，存在本底差异，难于区分。实验证明，临床样本之间的差别大于动物样本，而动物样本差异大于细胞培养样本；其三，最有效的标志物通常浓度很低，而样本量也有限，所以要求分析手段必须具备极高的灵敏度；最后，生物体内变化极其复杂，即使获得有很好灵敏度与特异性的单个标志物，要想通过设定此单个标志物的精确阈值来标定某一生理状态仍然非常困难。所以，通常生物体某一生理状态就需要由多个标志物共同来标定，而非单一标志物就可以完成。

一般来说，生物标志物的发现包括发现或鉴定（Discovery），验证（Verification），确认（Validation）三个步骤，而后再进入临床检验等更深入的阶段。鉴定步骤可以通过生物质谱仪与蛋白质差异表达定量等相关技术完成。但由于生物标志物必须具备广泛的代表性与标志性，所以验证与确认步骤的样本量通常是鉴定阶段的数十至数百倍，因此，验证与确认生物标志物的技术方法需满足4个要点（即4S要点）：速度快（Speed），特异性高（Specification），灵敏度高（Sensitivity）和具有统计学意义（Statistics）。而目前常规的Western Blot或ELISA方法，由于成本高、速度慢，特异性抗体制备难度大等诸多技术难题，很难在进行大批量样本验证与确认的阶段中发挥主要作用。因而就迫切需要有新的技术完成此项重任。

由于充分地认识到生物体标志物验证与确认工作的重要性、复杂性和广大研究人员的迫切需求，AB公司在此领域投入巨大资源，结合QTRAP系列质谱系统的独特功能与扫描模式，创造性地开发出MIDASTM（MRM Initiated Detection And Sequencing）工作流程，满足了4S要点的技术要求，可以准确、快速、简便地完成大样本量的生物标志物验证与确认工作。QTRAP是具有革新性设计的液相色谱-串联质谱仪，是一台集优异的定性功能与定量功能于一体的质谱仪，它把四极杆-线性离子阱质谱技术首次结合在一起（如图1所示），既保留了串联四极杆质谱仪（空间串联质谱）的优点，如：母离子扫描（PS）、中性丢失扫描（NL）、MRM定量功能；以及线性离子阱（时间串联质谱）的所有优点，如子离子扫描灵敏度高，MSn，高分辨扫描等等，又克服了传统3D离子阱质谱仪的缺点，如低质量截止点（1/3效应）、“空间电荷效应”、碰撞效率低、定量差等。更重要的是，同时还开发出了空间串联+时间串联的联动新技术，如MRM-EPI，MRM-MS3，MRM-NL等等。MIDASTM工作流程就是建立在这一高技术平台之上的。

图1. QTRAP 仪器结构示意图：具备完整的三重串联四极杆质谱，又增加了线性离子阱的功能，还首次完成了这两类质谱功能的集合和联动。

通过用其它各类技术方法，包括蛋白质组学相关技术，基因组学相关技术，各类已发表文献等，发现出具有潜在生物体标志物性质的蛋白质或基因，利用已知的该蛋白分子的基因序列或氨基酸序列，就可应用MIDASTM方法进行大批量样本的蛋白分子验证与确认工作。

其主要工作模式如下：将分子的基因或氨基酸序列输入MIDASTM设计器软件的序列框，设定相关参数后，软件自动构建排列出MRM扫描模式所需要的母-子离子对（如图2所示）。而后，3200 QTRAP或4000 QTRAP质谱仪通过MRM扫描模式对大批量的样本监测，查看是否有此排列的母-子离子对出现。如若信号出现，证明此分子在样本中存在，仪器将自动切换至MS/MS扫描模式，确定此母离子的碎片离子信息，并再次鉴定并确认该分子的结构。如若在MRM扫描工作中，未发现预期的母/子离子对，就说明该分子在此样本中不存在。由于MRM扫描模式高效快速，且具有极高灵敏度，因此非常适合于高通量验证与确认生物标志物。

图2. MIDASTM设计器软件的序列框口，设定相关参数后，软件自动构建排列出MRM扫描模式所需要的母-子离子对。

应用实例

这里给出一个应用案例，通过4000 QTRAP LC-MS/MS质谱系统提供一种全新的技术方案，去进一步确证质谱已经鉴定出的低丰度蛋白质的存在与否。所有预期的胰酶酶切蛋白质所产生的多肽通过MRM扫描模式监测，验证其是否存在，一旦信号被检测到，仪器会立刻自动切换到高灵敏度线性离子阱 - 增强子离子扫描方式（EPI）采集数据，从而确认蛋白质的真实存在性。这种MRM触发的检测与验证方法最近也被用于蛋白质酶切后低丰度磷酸化肽的检测[4,5]。

人体mRNA剪拼体（Spliceosome）的蛋白质组成和其主要成份——小核糖核蛋白颗粒（snRNP）U1, U2，[U4/U5/U6]（tri-snRNP）的复合物，如图3所示。在mRNA前体的体外剪切拼接过程中，几种不同的复合物按一定次序组装在mRNA前体上。除如图3所示的snRNPs外，还有一些相关联的暂时性结合的拼接因子，其中有些因子的数量很少，浓度极低。为了鉴定这些因子，这些复合物经甘油梯度离心后，使用LC-MS/MS进行分析鉴别。