如何获得精准的Western Blot实验结果？（二）

半干转：

对于半干转来说，也需要进行堆叠组装（滤纸，胶，膜需要放在转印buffer中进行预平衡）放在装置电极板的底部，盖上上极板，高强的电流通过三明治结构，转印速度较快，一般小于1h。

需要注意的是：低温对于膜的转印是至关重要的，尤其是在转印时间较长而无人监管的情况下。针对刚建的实验室平台或者一些新蛋白的研究，经过转印的胶和膜都要通过染色确定转膜效率（胶用考马斯亮蓝加热染色，膜用丽春红染色，均只需几分钟，并不耽误太多时间），不然后面的实验既费时也费抗体。

-  封闭

在做Western blot实验中，因固相载体(如NC膜，PVDF膜)表面有很多孔，通过电转，胶上的蛋白被转移到膜上，蛋白以机械填补(堆积)和吸附的方式结合于表面。蛋白塞进了表面孔里面，但是蛋白并不是连续的，而有很多空隙，抗体也是蛋白，也会被吸附在空的洞里，这样就会有很多非特异性的信号。

因为有“填补”和“覆盖”蛋白结合位点以避免一抗的非特异性结合，所以有“封闭”的说法。星博士在此介绍常见封闭液的一些特点，有助于大家选择：

常见的封闭液——BSA

BSA是最常用的封闭液，成分单一适用于大多数情况。若免疫原是偶联BSA的，BSA有很强的免疫原性，会导致产生很多针对BSA的抗体，为避免交叉反应，不能用BSA，脱脂奶粉封闭，可以选用酪蛋白或无蛋白的封闭液。

常见的封闭液——脱脂奶粉

脱脂奶粉最大的优点是价格便宜，但由于成分相对复杂，所以适用范围要狭窄一些。针对磷酸化蛋白的检测不能用脱脂奶粉，脱脂奶粉含有酪蛋白，该蛋白本身就是一种磷酸化蛋白，使用会造成高背景磷酸化抗体也许会导致背景增加，此外，因为自身含有生物素，不能用于生物素标记的抗体系统。

封闭体系并不是一成不变的，不同的封闭体系往往会得到不一样的实验结果，由此可见，做Western Blot实验中，封闭液的选择也是需要谨慎的。

不同封闭体系结果的差异

-  抗体孵育

一抗一般按照说明书进行稀释后，室温孵育1-2h，或者4℃过夜。为了让抗体充分与蛋白结合，大多数实验室一般会选择4℃过夜。一抗孵育结束后TBST洗涤三次，用稀释后的二抗，室温孵育1-3小时，TBST洗涤三次。

抗体是决定Western Blot实验成败的最关键因素，选择具有一定文献引用数的品牌不仅更容易得到清晰可信的结果同时更能够得到同行认可，针对一些表达峰度高且稳定的蛋白可以选择国产化抗体，既能保证实验结果准确性又可降低实验成本，抗体的保存往往也是大家最容易忽略的一个环节，而因抗体保存不当造成实验失败的例子比比皆是。

保存温度和条件（仅供参考）

对于很多抗体而言，分装成小等份并冻存于-20℃或-80℃是最佳保存条件。分装成小等份可最大程度减少由冻融造成的抗体效价降低，以及从单个试剂瓶中多次吸取而引入的污染。小等份只需冻融一次，如有剩余，可将剩余物保存于4℃，建议一周内用完。在收到抗体时，在10000×g下离心20秒以沉积截留于试剂瓶螺纹的溶液，并以小等份转移至低蛋白结合微量离心管中。小等份的量取决于实验人员在实验中通常采用的量。小等份应不小于10μl；等份越小，储液浓度因抗体蒸发及吸附于保存瓶表面而受到的影响越大。

在大多数情况下，收到抗体时在4℃下保存一至两周，然后再冷冻进行长期保存是可以接受的，但也许腹水液是例外，它可能包含蛋白酶，因而应该尽快冻存。不同品牌的抗体保存方式往往不同，具体保存方式需参考产品说明书。

-  检测

抗体孵育完，就到了Western Blot实验的最后一步——检测了。

目前最常用的检测方法是ECL化学发光法，主要针对HRP标记的二抗。思科捷为大家提供极超敏和超敏两种ECL发光液供大家选择。一款合适的发光液能使你的Western Blot图片更加美观。

Western Blot的基础部分就先讲到这里，欢迎小伙伴们在评论区留言，针对Western Blot实验的问题，星博士将一一为大家解答。