基因编辑鼠 sgRNA表达载体构建

继上次发表的Guide RNA设计和筛选的相关知识之后，希望大家还没有忘记相关的操作和技巧，今天，我们就来和大家聊聊后续的实验，在基因编辑鼠的过程中，sgRNA表达载体是如何构建的呢？

在靶点筛选结束之后，下一步就要进行sgRNA载体构建。在构建表达载体前，应根据实验目的选取合适的表达质粒。比如进行实验时考虑是否需要reporter标签，是否需要药物筛选基因等。

接下来以构建px330质粒为例，具体说明如何构建sgRNA表达载体。（图1）

1. 先确定20bp靶标序列（基因组序列应为20bp+NGG）；

2. 如20bp第一个为G，则略过此部分；在20bp前额外添加一个G，形成G+20bp序列（U6 human promoter转录时需要起始碱基为G）；

3. 在20bp或G+20bp 5’前添加caccg，形成cacc-G+20bp序列，则为Forward序列（直接合成即可）；

4. 将20bp或G+20bp 进行反向互补，并在5’前添加aaac，则为Reverse序列（直接合成即可）；

5. 合成的sgRNA正反向碱基（摩尔浓度为100μM）进行退火，使之碱基配对并形成双链结构；

6. BbsI酶切px330质粒，并对酶切后的载体进行回收；

7. 将退火配对后的sgRNA碱基用超纯水按1:200稀释，并与回收后的载体进行连接；

8. 连接产物进行转化，氨苄抗性固体培养板进行涂板；

9. 挑取单克隆菌落，扩大培养后提取质粒，并使用human U6通用引物对连接载体进行测序，检测sgRNA 碱基片段是否正确插入px330质粒。

图1.px330 sgRNA表达载体构建示意图

然而，在进行受精卵显微注射时为了增加基因编辑的效率，一般以RNA形式替代DNA质粒形式。以下为构建sgRNA体外转录载体pGS3-T7-sgRNA步骤。（图2）

1. 确定20bp sgRNA靶序列，按上述操作将其连接至BbsI酶切的pGS3-T7-sgRNA中，测序并挑选正确插入的质粒；

2. pGS3-T7-sgRNA质粒线性化：用DraI酶切1μg pGS3-T7-sgRNA质粒，37℃反应3h；

3. 以构建正确的pGS3-T7-sgRNA为模板，配制体外转录反应溶液（体系见表1）；

4. 将上述溶液均匀混合后轻微离心，将转录反应液收集于反应管底部，42℃反应 2 小时；

5. 加3μl RNase-Free DNase I至20μl反应体系中，充分混合后置于37℃反应30min；

6. 加77μl RNase-free 纯水以终止反应继续进行；

7. 使用酚氯仿和异丙醇方法纯化转录后的RNA；

8. 取反应液的一部分进行4% 琼脂糖凝胶电泳，确认体外转录后的 RNA 产物；

9. 测定RNA浓度，用以显微注射。 

   
   图2. pGS3-T7-sgRNA载体构建及体外转录示意图

   试剂	用量
   Transcription buffer ,10 x	2μl
   Template DNA ,200ng/μl	5μl
   ATP ,50mM	2μl
   GTP ,50mM	2μl
   CTP ,50mM	2μl
   UTP ,50mM	2μl
   Rnase inhibitor ,40U	0.5μl
   RNA polymerase , 50U	2μl
   RNase-free H2O	2.5μl

表1. sgRNA T7-体外转录反应体系

Cas9表达载体体外转录步骤。（图3）

1. pSP6-Cas9质粒线性化：用NotI单酶切5μg pSP6-Cas9质粒，37℃反应5h；

2. 0.8%或1%琼脂糖凝胶电泳，并进行DNA凝胶纯化回收，测定浓度；

3. 以纯化DNA为模板，按mMessage mMachine SP6体外转录试剂盒说明书配制反应溶液（体系见表2）；

4. 将上述溶液均匀混合后轻微离心，将转录反应液收集于反应管底部，37℃反应 2 h；

5. 加1μl TURBO DNase至反应溶液中，混匀并在37℃反应15min；

6. 加30μl nuclease-free 纯水及30μl 氯化锂溶液，混匀溶液并在-20℃冷冻30min；

7. 4℃、14,000g离心10min以沉淀mRNA，小心去除上清溶液。并用500μl 70%乙醇清洗一遍，同时再次4℃、14,000g离心10min；

8. 吸净上清乙醇溶液，室温干燥5min，最后用20μl RNase-free 纯水溶解mRNA沉淀，混匀后置冰上并测定浓度，最后置于-80℃或-150℃保存。

图3. pSP6-Cas9载体构建及体外转录示意图

表2. Cas9 mRNA SP6-体外转录反应体系

参考文献：

Shao Y et al., CRISPR/Cas-mediated genomeediting in the rat via direct injection of one-cell embryos. Nat Protoc. 2014Oct;9(10):2493-512.