靶向序列捕获和新一代测序前对石蜡包埋组织及新鲜冷冻组织进行DNA质控

靶向序列捕获和新一代测序前对福尔马林固定石蜡包埋组织及新鲜冷冻组织进行 DNA 质量控制

 

作者

Melissa Huang Liu

安捷伦科技有限公司

美国加利福尼亚州拉霍亚

Maria Celeste Ramirez

安捷伦科技有限公司

美国加利福尼亚州圣克拉拉


摘要

本文将介绍利用 Agilent 2100 生物分析仪系统的微控流芯片电泳，在新一代测序工作流程的 SureSelect 靶向序列捕获之前或期间，对福尔马林固定石蜡包埋组织及新鲜冷冻组织的 DNA 样品进行质量控制。借助 2100 生物分析仪系统可靠的 DNA 电泳技术，可提供弥散条带谱及详细的文库统计信息，例如峰高、平均弥散条带分子量、分子量分布和 DNA 浓度。FFPE DNA 样品的结果与新鲜冷冻组织和对照 DNA 的 DNA 分析结果具有可比性。

前言

最常用的临床样品保存和存档方法之一 是制备福尔马林固定石蜡包埋 (FFPE) 组织。全世界的组织库、医院及实验室内存档的 FFPE 组织样本数超过 4 亿个。组织样本通过解剖或活检进行收集，然后用福 尔马林固定以及石蜡包埋以保持其完整性， 用于组织病理学研究及显微镜观察。收集到的这些病变组织和正常组织未来可能会成为分子遗传学研究中非常有价值的资源。但是，从 FFPE 样品中进行 DNA 提取面临巨大的挑战^[1]。甲醛交联、降解以及单链和双链 DNA 相混合等常见问题会导致适合下游应用的 DNA 材料数量减少。因此，对用于新一代测序 (NGS) 等高灵敏度、成本高昂的应用的样品进行质量评估显得 尤为重要。

经验证，2100 生物分析仪是 NGS 工作流程中进行片段 DNA 和 DNA 文库分子量测定以及定量分析的一个重要工具^[2]。本文将介绍利用 2100 生物分析仪的芯片电泳技术对 NGS 靶向序列捕获工作流程中的FFPE 和新鲜冷冻 DNA 样品进行分析。

实验部分

材料

FFPE 及新鲜冷冻组织的 DNA 由西奈山医学院捐赠（美国纽约州纽约市）， NA10831-1 对照 DNA 购自科里尔研究所（美国新泽西州卡姆登）。QIAmp DNA FFPE 组织试剂盒购自 QIAGEN GmbH（德国希尔登）。Ambion RecoverAll 总核酸分离试剂盒购自 Life Technologies 公司（美国加利福尼亚州卡尔斯巴德）。E220样品前处理系统购自 Covaris 公司（美国马萨诸塞州沃本）。2100 生物分析仪、安捷伦 DNA 1000 试剂盒，以及安捷伦高灵敏度 DNA 试剂盒均来自安捷伦科技有限公司（德国瓦尔特布隆）。

样品前处理

采用 QIAGEN FFPE 组织试剂盒及 Ambion 核酸分离试剂盒提取病人 FFPE 肿瘤组织中的基因组 DNA。所有样品均采用 SureSelect 靶向序列捕获实验方案进行进一步处理^[3]。

采用芯片电泳进行 DNA 质量控制

DNA 电泳采用了 2100 生物分析仪，并根据生产商的实验方案^[4,5]，联用 DNA 1000 试剂盒或高灵敏度 DNA 试剂盒。并在区域 (Region) 表格中对弥散条带的浓度及平均分子量进行分析。峰高在色谱峰 (Peak) 表格中进行测定，如 SureSelect 实验方案中所述^[3]。

结果和讨论

要想成功实现靶向序列捕获和 NGS，关键是在样品前处理工作流程中的特定时间点对样品质量进行评估。在本文中，源自病人 FFPE 组织的基因组 DNA (gDNA)、新鲜冷冻肿瘤组织中相匹配的 gDNA，以及对照细胞系 DNA 均根据 SureSelect 实验方案进行处理。利用 2100 生物分析仪在一些关键步骤进行 DNA 样品质量控制(QC)：剪切后片段化、捕获前扩增及捕获后扩增（图 1）。
 

图1. SureSelect  靶向序列捕获的样品前处理工作流程。需要 DNA  QC  的步骤以红色框标识（A：剪切后，B：捕获前扩增，C：捕获后扩增）

剪切后片段化分析

源自 FFPE 样品的 DNA 采用两种不同的方法进行提取 — QIAGEN FFPE 组织试剂盒 (FFPE DNA Q) 和 Ambion 核酸分离试剂盒(FFPE DNA A)，并与相匹配的新鲜冷冻组织提取的 DNA 及对照 DNA 进行比较。所有样品均采用 Covaris 系统进行片段化。剪切后样品采用 DNA 1000 试剂盒分析(图2），结果显示各样品均出现 100 至 450 碱基的弥散条带。除了分子量及纯度信息外，100 生物分析仪还可提供每个样品的总 DNA 浓度，并对特定区域内的弥散条带定量。
 

图2. 剪切后的片段分布。使用 Agilent 2100 生物分析仪及安捷伦 DNA 1000 试剂盒分析样品所得的胶图及电泳叠加谱图。样品：FFPE DNA Q（红色），FFPE DNA A（蓝色），新鲜冷冻组织

DNA（绿色），对照 DNA（浅绿色）