如何减少western blot非特异性条带的产生？

非特异性条带？

没有什么比以多个条带结束你的western blot实验更令人沮丧。 这是我的样品吗？ 封闭液的问题？ 抗体的问题？ 如果您正在使用新的样本或抗体，答案可能是，也不确定。 通过一次更改一个变量，对Western进行故障排除是一个痛苦的过程。 我们不能完全地让你所有的问题都消失，但这里有一些提示可以帮助你提高你的印迹质量。

样品的问题？

样品质量差是多个条带的主要来源。 以下是蛋白样本可能出现的一些常见问题。

• 如果您观察到多个条带在预期分子量下，您的蛋白质很可能已经降解。 确保在蛋白质提取过程中添加蛋白酶抑制剂并保持样品低温状态。

• 如果条带大于预期分子量，请检查文献中的磷酸化，糖基化，乙酰化或甲基化等修饰，将蛋白放在更大尺寸的胶中进行跑胶。

• 如果到处都有条带，您可能加载了过多的样品，这些样品会导致对无关的裂解蛋白非特异性吸附。 在样品制备方面，不要忘记在上样前加热到至少60°C使样品变性。

• 您的目的蛋白可能与其他蛋白共享表位。 要进行检查，请运行BLAST搜索以查看目的蛋白的唯一性。

• 另一种可能性是，细胞系中的蛋白质表达随着时间的推移而逐渐消失。 如果可以的话，重新开始使用新的非传代细胞。

封闭液的问题？

使用错误的封闭缓冲液会给你的印迹带来灾难。 许多常用的封闭缓冲液可以掩盖目标上的表位，使其难以检测。 或者是封闭无效产生非特异性结合。


一抗和二抗的问题？

一抗和二抗也会产生麻烦。 在选择一抗时，通常有很多选择。 为获得最佳结果，请选择经过亲和纯化并根据您的应用进行验证的抗体。 亲和纯化从制剂中消除了大量非特异性免疫球蛋白，产生更干净的印迹。