五、cDNA与引物质量检测
取0.2ml薄壁PCR管，编号。向各管中加入含染料2×PCRTaqMix10ul;加入正反向引物各0.5ul(引物浓度10uM)，向管中加入混合的cDNA各1ul。各管补加水至20ul。
组份加量
2×PCRTaqMix10ul
10uMPrimerFW0.5ul
10uMPrimerRV0.5ul
TemplateDNA1ul
ddH2O混匀至20ul
混匀，置于TP600PCR仪中。95℃5min;95℃15s，60℃35s，40cycles;72℃5min;4℃pause。
取扩增产物各8μl，DL2000分子量标准5μl/泳道。1%琼脂糖凝胶120V电压下电泳25min。用凝胶紫外分析仪观察。
选择特异性好，扩增效率高的引物作为实时荧光使用引物。
六、利用相对定量的方法分析目的基因表达量的情况：
由于RNA纯化后得率不同、RNA反转录为cDNA的效率不同等客观因素，用于定量分析的初始样品浓度不同，因此，在进行基因表达调控研究中都会用一些看家基因来标准化，以校正因样品初始浓度不同而造成的差异。常用的看家基因有beta-actin，GAPDH，18SrRNA等。因此，在做基因表达调控分析时至少要做两个基因，目的基因和一个看家基因。
七、定量PCR检测：
取0.2ml薄壁PCR管，分别编号。向各管中加入2×qPCRTaqMix12.5ul，10uM各基因正反向引物混合物0.5ul，对应的cDNA各1ul。一管中不加模板用作阴性对照。各管补加水至25ul。
组份加量
模板(cDNA)/ddH2O1.0ul
10uM引物F/R0.5ul
2×qPCRMix12.5ul
ddH2O11.0ul
混匀，置于SLAN荧光定量PCR仪中。95℃5min预变性后，95℃15s→65℃35s(荧光检测)，40cycles。荧光定量PCR一般把退火和扩增设成一个温度，只在扩增出现问题时才会考虑设梯度。
八、扩增曲线和溶解曲线
实时荧光定量PCR（Real-TimePCR）实验流程
实时荧光定量PCR（Real-TimePCR）实验流程
溶解曲线全部为单峰表明为特异性扩增。
一般而言，荧光扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段，荧光信号指数扩增阶段和平台期，其形状是一条平滑的S型曲线。
如果在荧光背景信号阶段出现很多拐点，可能的原因是体系未混匀或者存在固态杂质;
如果向下探头后又很快抬头然后又向下探头，可能原因是体系中模板量太高，建议模板稀释后再用。
如果引物二聚体存在则阴性对照会出现抬头现象，这在Real-TimePCR中很难避免;
若是阴性对照的溶解曲线出现和样品中同样的峰，说明体系配置中存在污染，则实验结果不可用。
在溶解曲线中出现双峰有三种可能：
①引物峰，引物峰通常是两峰中的前面一个，消除的办法是降低体系中的引物量或重新设计引物;
②在做基因表达差异时容易出现DNA被扩增峰(只在引物跨内含子时存在)，出现原因是提取RNA时存在DNA污染，可以通过电泳验证，这时要重新消化RNA样品中的DNA;
③扩增非特异，这时要重新摸扩增条件或重新设计并验证引物。
九、表达差异的计算方法
绝对定量通过标准曲线计算起始模板的拷贝数;相对定量方法则是比较经过处理的样品和未经处理的样品目标转录本或是目标转录本在不同时相的表达差异之间的表达差异。
2-△△CT方法是实时定量PCR实验中分析基因表达相对变化的一种简便方法。
在有些情况下，并不需要对转录本进行绝对定量，只需要给出相对基因表达差异即可。显然，我们说X基因在经过某种处理后表达量增加2.5倍比说该基因的表达从1000拷贝/细胞增加到2500拷贝/细胞更加直观。
2-△△CT方法的推导(详见实时定量PCR和2-△△CT法分析基因相对表达量)
补充：在DNaseI消化样品RNA中的DNA后，需要对样品重新进行氯仿抽提，具体实验流程如下：
消化后总体积10Oul，体积太少，不利于抽提，我们往往补加200ulDEPC水。
1.向离心管中加入等体积氯仿(约300ul)，剧烈颠倒，充分混匀至中层出现白色片状沉淀。4℃14000rpm离心8min，取上清(约250ul)。
2.加入1/10体积的NaAC(3M)(约25ul)和预冷的等体积异丙醇(约280ul)，-20℃放置20min。
3.4℃14000rpm离心15min，去上清，注意不要触到沉淀。
4.加入1ml的75%乙醇，4℃14000rpm离心3min，去上清。
5.瞬时离心，用200ul(或10ul)的枪头小心吸去离心管底的残存液态(勿吸到管底的沉淀)。
6.把离心管放置于超净台晾至约5-10分钟(勿完全干燥，否则很难溶)。加入30~50μl的无RNase的水，静止1min后，振荡30sec，瞬时离心。
7.将提取的RNA立即进行下游实验，或放-20℃保存。
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