嗜肺军团菌核酸检测试剂盒（恒温荧光法）使用说明

致病菌检测系列基于独特的恒温荧光检测技术，可针对食品、饲料等样品中的致病微生物的特异核酸片段进行扩增，仪器实时监测扩增过程中的荧光信号变化，自动判读结果。本产品用于嗜肺军团菌的检测。检出限为10³ CFU/ml。 

◆ 产品组成（48测试）

◆ 适用仪器

Dhelix 1610、Dhelix 3210、ESE Tube Scanner、Genie II、Deaou-308c等恒温荧光检测仪，ABI 7500，LightCycler480，CFX 96等荧光PCR仪。

◆ 自备耗材和仪器

①灭菌1.5mL或2.0mL离心管；②灭菌0.2mL PCR管或八联管；③冰盒；④移液器（0.5-10μL，10-100μL，100-1000μL）及配套灭菌吸头；⑤离心机；⑥涡旋混匀器；⑦金属浴

◆ 注意事项

1．本试剂检测灵敏度高。为了防止污染，实验要分区操作。

1）第一区：试剂准备区。

2）第二区：样本制备区。

3）第三区：模板添加区。

4）第四区：扩增及产物分析区。

★ 分区之间最好进行物理性隔离，避免人为因素造成的污染。

2．实验过程中穿戴工作服和乳胶手套，不同区域独立使用工具，需更换手套和实验服。

3．严格按照操作步骤操作，试剂配制和加样等步骤请严格按照说明书要求在冰盒上操作。

4．反应液中的成分对光敏感，应避光保存。试剂使用前要完全解冻，但应避免反复冻融，推荐使用前离心30秒，并按检测频次将反应液以适当体积分管保存。

5．反应结束后，扩增管请置于密封袋内丢弃，当日清理，开盖易造成气溶胶污染，禁止开盖。

6．不同批号试剂请勿混合使用，在有效期内使用。

7. 检出限为10³ CFU/ml是以1 ml 10³ CFU/ml增菌液离心后收集菌体再提取的细菌基因组DNA作为模板。

◆ 样品处理

参照《WS 394-2012 公共场所集中空调通风系统卫生规范》中附录B，采集集中空调系统冷却水、冷凝水及其

形成的沉积物、软泥等样品中的水样并测定嗜肺军团菌。其它洗浴水、温泉水、景观水等样品中的嗜肺军团菌测定可参照执行。

取灭菌的500 ml铁质布氏漏斗及配套的0.22 μm无菌滤纸，安装于真空抽滤装置上；取采集的水样，颠倒混匀，

将200 ml水样倒入漏斗；打开真空泵进行抽滤，富集菌体于0.22 μm滤纸上；取出过滤后的滤纸转移到灭菌塑料离心管内，加入2 ml 无菌水，用移液器反复冲洗并置于振荡器上充分振荡，使过滤物溶于无菌水。

详细步骤请按照标准操作或查阅食安通软件。

◆ 实验操作

将试剂完全解冻，各组分离心30s。

1. 试剂配制（试剂准备区，放置于冰盒中进行）：

若有N个待检样品，则参照下表，按照N+2个数量计算各组分用量（N个待检样品+1个阴性对照+1个阳性对照），将反应液置于0.6ml或者1.5ml离心管中，涡旋混匀，离心30秒，分装于0.2ml PCR管中，并向每管加入1滴C-I（约20μl）。

1. 模板制备（样本制备区）

1）将菌悬液摇匀稍静止，取菌悬液1 mL，10000 rpm 离心3 min，尽量弃净上清液；

2）涡旋混匀DNA提取液，向沉淀中加入100 μL D-I，涡旋混匀，100℃加热5 min；

3）10000 rpm离心3 min，将上清液转移至新的离心管中备用（2 μL上清用于核酸扩增）。

3．添加模板（模板添加区，放置于冰盒中进行）

在步骤1中已含有反应液的PCR管中加入2μL模板，顺序为NG-I、待测样品模板、PG-LS-I。涡旋混匀30s，离心1min，立即进行扩增反应。

4. 扩增反应（扩增及产物分析区）

①恒温仪器63℃条件下反应30min。

②若使用荧光定量PCR仪，则荧光基团选择FAM，淬灭基团选择None，将63℃ 15 s，63℃ 45 s作为一个循环，于63℃ 45 s处收集荧光信号，30个循环。 

其他仪器请参照仪器说明书进行设置。

◆ 结果判定

①仪器自动判定结果，若显示“阳性”，则样品中含有嗜肺军团菌；若显示“阴性”，则样品中不含有嗜肺军团菌或含量低于检测限。

②在荧光定量PCR仪上，根据有无“S”型扩增曲线判定结果。若有“S”型扩增曲线，则样品中含有嗜肺军团菌；若无“S”型扩增曲线，则样品中不含有嗜肺军团菌或含量低于检测限。 

NG反应管结果显示“阴性”，PG反应管结果显示“阳性”，此次检测结果有效，否则无效。