动物组织基因组DNA提取试剂盒使用说明（二）

六、方案1. 动物组织DNA提取

该方案适合于从1~20mg动物组织，如肝脏、脾脏、肾脏、老鼠尾巴等组织样品中提取DNA，以下离心操作都在室温进行。

• 把1~20 mg组织样品(或10 mg肝脏、肺或脾脏)剪切成尽量小的碎片，并转移至1.5ml离心管中。加入230µl Buffer MTL和20µl Proteinase K，涡旋混匀。55℃水浴1~3小时或过夜消化样品。水浴期间需偶尔涡旋混匀，或放置于振荡水浴涡中。

注：适当的组织用量才能获得理想的提取结果，样品过多会降低产量和纯度。脾脏、肝脏、肾脏等组织样品富含DNA，不宜超过10mg。肌肉和皮肤等样品用量可用到30mg以提高产量。将组织块尽量剪切成小碎片可缩短消化时间。采用液氮研磨，匀浆器处理组织样品可达到缩短消化时间的目的。小鼠尾巴最大用量为1.2cm，大鼠尾巴最大用量为0.6cm。消化时间取决于样品的类型和匀浆效果。一般组织样品需1-3小时，老鼠尾巴需6-8小时。过夜消化没有负面影响。

• 加入5µl RNase Solution至消化液中混匀。室温或37℃水浴锅中放置15~60分钟降解RNA。

注：RNase Solution消化时间取决于样品类型。肝脏和肾脏富含RNA，需较长的消化时间。

• (可选)10,000rpm离心3分钟。转移上清液至新的1.5ml离心管中。

注：若消化液比较浑浊或存在明显的颗粒，不要省略此步。

• 加入250µl Buffer AL至消化液中。最高速度涡旋混匀30秒。70℃水浴10分钟。

• 加入250µl无水乙醇至消化液中。最高速度涡旋混匀30秒。

注：处理肝脏或脾脏等组织时，加入乙醇时会有沉淀形成，属正常现象。用移液枪吸打10-15次尽量打散沉淀团。

• 把DePure gDNA Mini Column装在2ml收集管中。转移第五步获得的混合液(包括沉淀)至柱子中。10,000rpm离心1分钟。

注：若柱子出现堵塞，延长离心时间。

• 倒弃流出液，把柱子重新装回收集管中。加入500µl Buffer GW1(已用乙醇稀释)至柱子上。10,000rpm离心1分钟。

注：Buffer GW1须用无水乙醇稀释。按瓶子标签或说明书指示进行稀释。

• 倒弃滤液，把柱子重新装回收集管中。加入500 µl Buffer GW2(已用乙醇稀释)至柱子中。10,000rpm离心1分钟。

注：Buffer GW2须用无水乙醇稀释。按瓶子标签或说明书指示进行稀释。

• 倒弃滤液，把柱子重新装回收集管中。再加入500 µl Buffer GW2(已用乙醇稀释)至柱子中。10,000rpm离心1分钟。

• 倒弃流出液，把柱子重新装回收集管中。10,000 × g离心2分钟去除柱子中残留的乙醇。

• 将柱子装在新的1.5ml离心管中。加入30~100µl预热至70℃ Buffer AE至柱子的膜中央。放置3分钟。10,000 rpm离心1分钟。

• (可选)再加入30~100µl预热至70℃ Buffer AE至柱子的膜中央。放置3分钟。10,000 × g离心1分钟。

注: 处理DNA含量很低的样品无需第二次洗脱。

• 丢弃DNA结合柱，DNA保存于2-8℃，长期保存需保存于-20℃。

七、方案2. 体液/细胞DNA提取

该方案适合于从动物血液，血清，血浆，唾液等液体样品中直接提取DNA，以下离心操作都在室温进行。

• 样品的处理

  • 红细胞带核的血液样品：鸟类/鱼类等非哺乳类动物血液的红细胞带细胞核，其DNA含量极为丰富。在1.5ml离心管中，加入1-10µl抗凝血液样品。用Buffer PBS或灭菌水调整总体积为200 µl，涡旋混匀，按第2步进行。

  • 红细胞不带核的血液样品：在1.5ml离心管中，1-200µl抗凝血液样品。用Buffer PBS或灭菌水调整总体积为200 µl，按第2步进行。

  • 唾液或其它液体样品：在1.5ml离心管中，加入1-200µl唾液或其它液体样品，用Buffer PBS或灭菌水调整总体积为200 µl，按第2步进行。

  • 培养细胞(5 x 10⁶)：500 rpm离心收集细胞，倒弃培养液。加入200µl Buffer PBS或灭菌水涡旋重悬细胞。

• 加入20µl Proteinase K至样品中，轻轻拍打几次混匀。

• 加入200µl Buffer AL至样品中，最高速度涡旋混匀30秒。65℃水浴30分钟。

注：若需去除RNA，加入5ul RNase A至消化液中，室温静置15~30分钟。

• 加入200µl无水乙醇至消化液中。最高速度涡旋混匀30秒。

注：若加入乙醇后有沉淀形成，用移液枪吸打5次打散沉淀团。

• 按方案1的第6~13步进行操作。

八、常见问题解答

该列表可能有利于您解决在提取过程中所碰到的问题。若您对试剂盒存在疑问或有良好的建议，又或者您在分子生物学实验中碰到问题，都请您联系我们。我们将竭尽所能为您排扰解难。