产品说明
病菌检测系列可针对食品、饲料等样品中的致病微生物的特异核酸片段进行扩增，仪器实时监测扩增过程中的荧光信号变化，自动判读结果。本产品用于致泻大肠埃希氏菌的检测。检出限为103 CFU/ml。
产品组成（96测试）
试剂 | 含量 | 作用 | |
孔1 | 反应液-uidA | 23μl/孔 12孔/排 8排 （本产品使用12联PCR管分装，每排含12种反应液各23ul） | 内参 |
孔2 | 反应液-ipaH | 鉴定EIEC | |
孔3 | 反应液-pic | 鉴定EAEC | |
孔4 | 反应液-aggR | 鉴定EAEC | |
孔5 | 反应液-astA | 鉴定EAEC | |
孔6 | 反应液-stx1 | 鉴定EPEC与EHEC | |
孔7 | 反应液-stx2 | 鉴定EPEC与EHEC | |
孔8 | 反应液-bfpB | 鉴定EPEC与EHEC | |
孔9 | 反应液-escVa | 鉴定EPEC与EHEC | |
孔10 | 反应液-lt | 鉴定ETEC | |
孔11 | 反应液-stp | 鉴定ETEC | |
孔12 | 反应液-sth | 鉴定ETEC | |
NG-Ecoli | 100μL × 1支 | 阴性对照 | |
NG-DW | 100μL × 1支 | 空白对照 | |
PG-Ecoli | 100μL × 1支 | 阳性对照 | |
Loading Buffer | 600μL×1支 | 电泳上样缓冲液 |
◆ 所需仪器
ABI ，BioRad，TaKaRa等PCR扩增仪，电泳仪，凝胶成像仪等电泳配套设备。（使用荧光定量PCR仪进行定性判读时则无需电泳设备）
◆ 自备耗材和仪器
①灭菌1.5mL或2.0mL离心管；②冰盒；③移液器（0.5-10μL，10-100μL，100-1000μL）及配套灭菌吸头；④离心机；⑤涡旋混匀器；⑥金属浴。
◆ 样品处理
参照《GB4789.6—2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 致泻大肠埃希氏菌检验》中的操作步骤进行前增菌。建议使用试剂配套细菌基因组DNA提取系列产品。
◆ 实验操作
1．添加模板（样本制备区，放置于冰盒中进行）
取所待检样品数+3的12联反应管，将试剂完全解冻，分离心30s。离心后揭开封口膜，使用穿刺加样法穿过固封层向每管反应液中分别加入2μL模板（或直接使用无菌吸头挑取少许待检菌落至反应管中）。
加样示例：（有2个待测样品）
取5排12联反应管，按顺序第一排全部加NG-DW，第二排全部加NG-Ecoli，第三排全部加样品1，第四排全部加样品2，第五排全部加PG-Ecoli。
盖好配套的PCR管盖后，涡旋混匀30s，离心1min，立即进行PCR扩增反应。
2. 扩增反应（扩增及产物分析区）
按下列条件设置扩增反应：（如需使用荧光法进行检测请选择FAM通道）
PCR循环 | 荧光收集位点 | ||
95℃ | 10分钟 | 1个循环 | — |
95℃ | 30秒 | 30个循环 | — |
63℃ | 30秒 | — | |
72℃ | 90秒 | ※ | |
72℃ | 5分钟 | 1个循环 | — |
3. 产物电泳（扩增及产物分析区）
称量4. 0g琼脂糖粉，加入至200 mL的1×TAE电泳缓冲液中，充分混匀。使用微波炉反复加热至沸腾，直到琼脂糖粉完全融化形成清亮透明的溶液。待琼脂糖溶液冷却至60℃左右时，加入溴化乙锭( EB )至终浓度为0.5μg/mL，充分混匀后，轻轻倒入已放置好梳子的模具中，凝胶长度要大于10cm，厚度宜为3mm~5mm。检查梳齿下或梳齿间有无气泡，用一次性吸头小心排掉琼脂糖凝胶中的气泡。当琼脂糖凝胶完全凝结硬化后,轻轻拔出梳子，小心将胶块和胶床放入电泳槽中，样品孔放置在阴极端。向电泳槽中加入1×TAE电泳缓冲液，液面高于胶面1mm~2mm。将 5μL PCR产物与1μL 6×上样缓冲液混匀后，用微量移液器吸取混合液垂直伸入液面下胶孔，小心上样于孔中；阳性对照的 PCR 反应产物加入到最后一个泳道;第一个泳道中加入 2 μ L 分子量 Marker 。接通电泳仪电源，根据公式：电压=电泳槽正负极间的距离（cm）×5V/cm计算并设定电泳仪电压数值；启动电压开关，电泳开始以正负极铂金丝出现气泡为准。电泳30min~45min后，切断电源。取出凝胶放入凝胶成像仪中观察结果，拍照并记录数据。
可使用Gold view、Gal-Rad等等效的核酸荧光染料替代EB。
推荐使用DNA Marker：DL2000或100bp ladder，等可指示100bp~1500bp条带的Marker。
结果分析
阴阳性判读：
进行电泳检测时，需对比Marker进行判断，当目的靶标对应位置出现单一显著条带时可判断该靶标为阳性；否则为该靶标检测为阴性。（使用荧光定量PCR仪检测时，检测孔Ct≤30时判断该孔为阳性；当检测孔Ct＞30时，该检测孔为阴性）
示例电泳图
有效性判读：
需同时满足：1.空白对照中所有泳道均为阴性；2.阴性对照中uidA泳道阳性，其余泳道阴性；2.阳性对照中所有泳道阳性，此时可判断实验有效。如无法满足上述条件，则实验无效，需重复实验；如重复后结果仍为无效，请于本公司技术支持联系。
结果判读：
在实验有效的情况下，可根据下表进行判读：
致泻大肠埃希氏菌类别 | 目标条带的种类组合 | |
EIEC | ipaH（＋） | uidA （＋／－） |
EAEC | aggR，astA，pic中一条或一条以上阳性 | |
EPEC | bfpB（＋／－），eae（＋），stx1（－）stx2，（－） | |
STEC/EHEC | stx1，stx2中一条或一条以上阳性，eae（＋／－），bfpB（－） | |
ETEC | lt，stp，sth中一条或以上阳性 |
97%以上大肠埃希氏菌为uidA阳性，可参考阴性对照中该基因检测结果判断扩增效果；
当结果判定为EPEC阳性时，若bfpB靶标为阳性则说明样品含有典型EPEC；若bfpB靶标为阴性则说明样品为非典型EPEC；
当结果判定为STEC/EHEC阳性时，若eae靶标为阳性则说明样品含有典型EHEC；若eae靶标为阴性则说明样品为非典型EHEC。
◆ 注意事项
1．本试剂检测灵敏度高。为了防止污染，实验要分区操作。
1）第一区：样本制备区。
2）第二区：扩增及产物分析区。
分区之间最好进行物理性隔离，避免人为因素造成的污染。
2. 实验过程中穿戴工作服和乳胶手套，使用移液器，试验产生的所有废弃物及时处理。
3．严格按照操作步骤操作，试剂配制和加样等步骤请严格按照说明书要求在冰盒上操作。
4．反应液中的成分对光敏感，应避光保存。试剂使用前要完全解冻，但应避免反复冻融，推荐使用前离心30秒。
5．不同批号试剂请勿混合使用，在有效期内使用。
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