细胞周期的四种检测方法详解（二）

2 数据分析

MiniMax 细胞计数仪的透射光模块可以从自动聚焦得到更好的图像效果。SoftMax Pro 软件中的“Field Analysis”能进行自定义分析从而鉴别细胞重叠的部分。我们应用一种特殊的鉴别方法来区分目标球体和其余物体，如残渣和个体细胞，从而在后续的分析中予以去除 (Figure 2, A and E)。最后，我们选择感兴趣的区域并从图像中去除不想要的物体。在绿色和红色荧光通道中，球体可以通过“Object Count”模式中大小和与背景相对荧光强度的区别被轻易的筛选出来 (Figure 2, B-D, F-G)。然后运用SoftMax Pro 软件计算图像的“% Area coverage”和球体的“Object Area” (μm²)。图像的获取和分析的设置方法见表 1。

3 结果

SoftMax Pro 软件中获取及分析的设置可以在绿色和红色荧光通道的透射光下简便快速地分辨每个孔中的单球体。SoftMax Pro软件还可计算所有通道包含的面积占比和物体面积 (μm²) (图 3，表 2)。在绿色和红色荧光通道下可以获得最好的结果。对于 FUCCI 球体来说，图 3 中红色部分展示的是光滑圆润的球体而绿色部分则在细胞表面，说明球体内部的细胞处在 G1 期而表面细胞即将进入 M 期。对应软件可以分辨球体大小和形状 ( 球形参数 ) 的各种变化，因此常用来研究多种处理，如抗癌药物，对细胞增殖的影响 ( 图4 )。MiniMax 中绿色和红色荧光的光学成形功能可以将 3D 图像转换为 2D 投射球体图。

四、高内涵检测法

方法

1. 准备细胞悬液，40,000 细胞 / mL 的 Hela 细胞悬液与 30 颗粒 / 细胞浓度的 FUCCI 试剂混合，以 4,000 细胞 / 孔的浓度种在 96 孔板中，孔板置于 37 °C，5% CO2 的环境下贴壁 8 小时。
2. 不同浓度的有丝分裂抑制剂处理细胞，然后孔板放入 ImageXpress Micro 系统。
3. 每隔 2-3 小时系统自动拍摄一次图片，使用 20 倍 Plan Apo 物镜，同时获取明场及两个荧光通道 FITC 和 TRITC 的图像。实验持续 48 - 72 小时，细胞可完成 1 - 2 次分裂。
4. 分析延迟实验图像使用 MetaXpress^® 高内涵成像与分析软件的用户自定义模块。

Premo^® FUCCI 细胞周期指示剂结合配置环境控制的 ImageXpress Micro 高内涵成像系统和 MetaXpress 高内涵分析软件，可实现高效的活细胞周期精确测量。高通量筛选技术可为科学家提供一个快速、自动的基于图像定量分析细胞周期的方法，并能够完整地记录长时间内的细胞周期变化。另外，MetaXpress 软件能够在明场图像识别细胞，避免了染料对活细胞的毒性。同一标准具有统计学意义的定量分析方法可评价多化合物在不同浓度对细胞周期影响的相关参数。