简介
线粒体功能作为细胞健康度评价的关键指标，可以通过检测其膜电位变化情况获得相应数据。线粒体膜电位去极化作为低氧损伤或氧化应激反应的早期重要的一种信号，阳离子荧光染料是用于线粒体膜电位评估的有效工具。我们利用两种已知的氧化磷酸化抑制剂作为化合物进行短时间 ( 60分钟 ) 的处理。抗霉素A (Antimycin A) 和氰氯苯腙 (CCCP)。化合物处理后利用 MitoTracker Orange和细胞核染料分子进行染色，此实验可直接检测化合物对线粒体膜电位的影响。
方法
U2OS 细胞 (ATCC) 以 6,500 个每孔的密度预铺于黑色底透 384 孔板中 (Greiner,black clear-bottom plates)，随后第二天利用不同浓度的 Antimycin A 和 CCCP(Sigma) 处理 60 分钟，每个处理进行三个重复，化合物 Antimycin A 起始浓度为100 μM 和化合物 CCCP 起始浓度为 50μM，稀释比例为 1:3，经过 30 分钟化合物处理后，使用 MitoTracker Orange 和Hoechst 33342 染料 (Thermo Fisher,Carlsbad, CA) 对细胞进行染色，反应体
图一：利用自动成像系统评价线粒体完整性和膜电位变化。ImageXpress Pico 自动细胞成像系统的20X 物镜分别对 U2OS 质控组细胞和 CCCP 处理后的U2OS 细胞成像后，利用 CellReporterXpress 软件对图像进行分析。左侧：成像质控组细胞和 1 μM 的 CCCP 处理后的细胞，MitoTracker Orange 染料 ( 桔色 )和 Hoechst 核染料 ( 蓝色 ) 分子进行的染色处理；右侧：成像分析绿色遮蔽为细胞核染色后结，白色遮蔽颗粒为线粒体。 细胞经过氧化磷酸化抑制剂CCCP 处理后膜电位丢失
系于 PBS 中且最终各自的使用浓度分别是0.1 μM 和 6 μM。细胞染色过程于 37 ℃，5% 的 CO2 体系中 30 分钟，对活细胞可直接成像分析或者使用 4% 多聚甲醛固定后在进行相应观察。在室温条件下使用 4%多聚甲醛经过 30 分钟左右时间对细胞进行固定，利用 PBS 缓冲液清洗 2 次，细胞直接在 ImageXpress Pico 自动细胞成像系统上使用 20x 物镜进行观察，图像获取采用每孔单点方式，利用其 DAPI 和TRITC 荧光通道且曝光时间分别为 20 ms和 300 ms。
客观多参数分析线粒体完整性和膜电位的变化
如下图一所示，质控组细胞和氧化磷酸化抑制剂 CCCP 处理后的细胞，可以观察到期线粒体完整性 ( 桔色 ) 有着显著的差异，我们利用 CellReporterXpress 软件预置的线粒体分析模板来评价其线粒体损伤。细胞核染色后确定单个细胞，分析发现每个细胞内颗粒 ( 线粒体 )，可以采用多个参数进行结果分析，例如颗粒总数、颗粒面积、每个细胞内的颗粒数目、平均荧光强度和颗粒的整体荧光信号强度。结果以浓度效应学曲线展示出其 EC50 值，如图二和表一所示。
结论
线粒体功能紊乱与各种疾病的发病机制有关，包括神经退行性疾病和心血管疾病，以及一些药物的毒性作用和各种环境中化合物影响。这次实验展示出 ImageXpress Pico自动细胞成像系统和CellReporterXpress软件可在基于细胞学实验应用方面，有效对线粒体膜完整性和电位的变化进行综合有效的评定。
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