单细胞测序的重要性及应用方向（二）

3 在神经科学中的应用

单细胞测序技术帮助科学家更深入的了解大脑神经细胞。2017年，Salk生物研究所领导的团队根据甲基化和调控特征，区分小鼠和人类大脑样本中的神经元亚型，并鉴定出人类额叶皮质中一组新的神经元[6]。研究人员利用单细胞甲基化测序分析小鼠和人类额叶皮质样本中近6200个神经元，并根据甲基化和调控元件特征对已知的神经元亚型进行聚类。此外，他们还指出人类大脑中存在一种新的神经元亚型，称为“第6层兴奋性神经元”，它们有着独特的甲基化标记。

这篇论文的通讯作者之一、Salk研究所的计算神经生物学研究人员Margarita Behrens表示：“我们的研究表明，我们能够根据神经元的甲基化组来清晰定义神经元类型。这有助于我们了解同一区域、外表相似的两种神经元为何表现不同。”

图6: 通过高通量单细胞甲基化测序得到小鼠和人额叶皮层神经元细胞的亚型

2018年初，张鹍教授团队在Nature Biotechnology上发表了一个基于全新单细胞核测序方法的成年人脑第二代单细胞图谱[7]。该研究通过结合基于微流体的单核测序（snDrop-seq）和单细胞转座体超敏性位点测序（scTHS-seq）的方法，不仅能利用转录组学分析鉴定不同功能的细胞类型，还能通过表观遗传学特征更好描述这些表达图谱是如何调节或者维持的。该研究检测了超过60，000个来自成人大脑皮层和小脑的单细胞，发现了35种不同的神经元和神经胶质细胞亚型。并且发现了这些细胞中哪些亚型更易受到不同脑部疾病常见危险因素的影响。

图7:成人大脑不同区域细胞类型的多样性

4 在免疫学领域的应用

由于传统的免疫细胞分析方法，取样来自一大堆细胞，低估了单个免疫细胞的多样性，所以我们需要更加精确检测单个免疫细胞的遗传物质，从而理解机体复杂的免疫机制。

2017年，Ido Amit团队在大脑中发现一种新型免疫细胞——disease-associated microglia（DAM）[8]，证实DAM细胞负责降解死亡的细胞以及与阿尔兹海默症相关联的蛋白病斑。研究人员强调，只有对单个细胞进行RNA测序才能发现罕见的小胶质细胞，从而为治疗包括阿尔兹海默症等在内的神经类疾病提供新方法。

图8. 单细胞测序发现新型免疫细胞

2017年，来自Broad研究所等机构的科学家们借助单细胞基因组学技术在人类免疫系统中鉴定出了新型细胞[9]。他们通过对健康献血者分离获得的约2400个单细胞RNA进行了测序，并富集HLA-DR+细胞系，尝试 对DC细胞和单核细胞的分类进行重新鉴定和修订。这一成果是人类细胞图谱（Human Cell Atlas）计划的首批重要发现之一。该计划旨在描述人体内的每一个细胞，以期加速生物医学的发展，将彻底改变医生和研究人员如何理解、诊断和治疗疾病。

图9.人类血液中树突细胞和单核细胞图谱

结语

单细胞测序技术从诞生至今，仅仅短短数年的时间，便取得了飞速的发展以及瞩目的成果。2009年、2010年，在顶级期刊发表的单细胞测序技术类文章数均仅有3篇。而到2013年、2014年该数目分别为23及27篇。现在单细胞测序技术越来越受到科研工作者及临床工作者的青睐，每年有越来越多的重要成果发表在顶级期刊上。

而华大基因，在单细胞测序领域也取得了重大突破。2012-2017年，在单细胞测序领域华大基因一共发表了15篇文章，影响因子最高44，累计影响因子高达189。下面图表是华大基因在单细胞测序领域的代表性文章：

表1.华大单细胞测序高分文章列表

参考文献

[1]  朱忠旭, 陈新. 单细胞测序技术及应用进展[J]. 基因组学与应用生物学, 2015, 34(5): 902-908
[2]  Hou, Y., Song, L., Zhu, P., et al. Single-cell exome sequencing and monoclonal evolution of a JAK2-negative myeloproliferative neoplasm. Cell. 148, 873-885.
[3]  Xu, X., Hou, Y., Yin, X., et al. Single-cell exome sequencing reveals single-nucleotide mutation characteristics of a kidney tumor. Cell. 148, 886-895.
[4]  I Tirosh, AS Venteicher, C Hebert, LE Escalante, AP Patel, et al. Single-cell RNA-seq supports a developmental hierarchy in human oligodendroglioma. Nature, 2016, 539(7628): 309-313.
[5]  Lan, F., Demaree, B., Ahmed, N. & Abate, A. R. Single-cell genome sequencing at ultra-high-throughput with microfluidic droplet barcoding. Nat. Biotechnol. 2017，35, 640–646.
[6]  C Luo, CL Keown, L Kurihara, et al. Single-cell methylomes identify neuronal subtypes and regulatory elements in mammalian cortex. Science, 2017, 357(6351):600.
[7]  Lake BB, Chen S, Sos BC, Fan J, Kaeser GE, Yung YC, Duong TE, Gao D, Chun J, Kharchenko PV, Zhang K. Nat Biotechnol. 2018; 36(1):70-80. Integrative single-cell analysis of transcriptional and epigenetic states in the human adult brain.
[8]  Keren-Shaul H, Spinrad A, Weiner A, et al. A Unique Microglia Type Associated with Restricting Development of Alzheimer’s Disease[J]. Cell, 2017, 169(7):1276.
[9]  Villani AC, Satija R, Reynolds G, Sarkizova S, et al.  Single-cell RNA-seq reveals new types of human blood dendritic cells, monocytes, and progenitors. Science,2017, 356(6335). pii: eaah4573.