IHC/ICC/IF ,傻傻分不清楚？它们都是用于定位检测抗原表达的免疫检测技术，由于技术相对简单且直观，在科研和临床上都得到了大量使用。但是影响最终检测效果的变量非常多；每一个具体的检测都会遇到多个需要调整的变量。具体到选择何种方法来保存组织样本；固定标本该用醇还是醛；如何选择最合适的一抗；抗原修复具体该用什么样的方法及条件等等一系列的问题都需要考虑。
因此在开始实验之前，最好先掌握以下几组免疫检测技术中的常识，能够分清它们的特点将使你做出更好的实验设计，提高实验成功率。
石蜡切片VS冰冻切片
▶ 石蜡切片
石蜡包埋是最廉价且常用的组织包埋法，适用于需要长期保存的标本。在包埋之前须先将样本固定，固定时间通常在4~24小时，需要考虑过度固定导致的抗原被遮蔽。在不能立即包埋的情况下，固定完成后的组织可以暂存在乙醇中。如果用树脂替代石蜡做包埋剂，可以得到更薄的组织切片（1.5μm vs. 5μm）。石蜡切片步骤繁多，制片中抗原活性有所减低，但组织结构和细胞形态清晰，是免疫组织化学常规制备切片方法。
▶ 冰冻切片
冰冻切片无法长期保存，而且冷冻过程中冰晶形成容易影响亚细胞结构，使得组织结构不如石蜡切片清晰。冰冻组织切片可以在-80℃ 保存一年。冰冻切片步骤简单快速，样本不需要固定即可直接用液氮或者液态异戊烷、干冰等进行冰冻处理。冰冻和切片之后用乙醇固定切片可以避免表位被甲醛交联，无需进行抗原修复。
在检测诸如磷酸化或者一些对有机溶剂或热的温度耐受能力较差的细胞膜表面抗原和水解酶时，采用冰冻切片是很好的选择。
甲醛固定VS醇固定
▶ 甲醛固定
甲醛是用于保存蛋白最常用的固定剂。甲醛能够在多种蛋白质末端基团之间形成交联，从而达到固定的效果。但是甲醛固定会改变抗原表位且阻止抗体结合。因此常常用酶消化或热抗原修复法来使蛋白与甲醛交联的醛键断裂开，以便后续染色。在检测磷酸依赖型的表位，选用冰冷的无水甲醇或无水乙醇来固定更为合适。
▶ 醇固定
常用的醇类固定剂有甲醇和乙醇，其固定的原理是与水竞争蛋白质中的氢键，从而替代组织中的水分子，在影响蛋白质三级结构的同时稳定其二级结构。醇类会溶解脂类物质、并且对组织收缩较大，因此通常认为醇类固定不利于保护组织形。由于醇类固定会在组织表面很快形成一层蛋白膜，这层膜会影响固定液渗透，造成中间的组织固定不佳，因此醇类通常用于，固定冰冻组织切片和细胞，更适合于细胞膜表面抗原。醇固定之后不建议进行抗原修复，避免破坏样本完整性。
组织固定VS细胞固定
▶ 组织固定
全动物灌流固定往往是保存抗原的最佳方法，适用于对小鼠、大鼠和豚鼠的完整组织的研究。剥离出来的组织可以用固定剂浸泡固定。常用的固定剂是是 PBS 配制的 4% 甲醛溶液。厚度在10 mm内的组织比较有利于固定剂渗透。为增强固定剂的穿透，。对于完全固定，固定剂的体积至少是组织体积的 50～100 倍。
▶ 细胞固定
细胞的固定比组织固定所需时间更短，可以使用浓度更低的固定剂。一般来说用 2% 的甲醛溶液在室温下固定 20
分钟就足以保存细胞形态和抗原性。大部分细胞只要去除培养基然后加入固定剂即可，对于一些去除培养基后会受到表面张力破坏的细胞，可以直接加入与培养基等体积的固定剂，对细胞进行预固定。两分钟后，去掉预固定培养基，加入新鲜的
2% 的固定剂继续完成固定即可。
热诱导修复VS酶诱导修复
▶ 热诱导的表位修复（HIER）
在抗原修复过程中需要考虑抗原、抗体、组织类型、固定方法及持续时间等因素，因此需要针对各因素来优化修复方案。常用的热诱导表位修复可以用各类加热设备开展，微波炉是最为方便的设备，选择适合的热修复缓冲液在适当的温度和时间下能够达到不错的修复效果，这些条件都是需要根据经验来确定的。在HIER法中，最重要的一点是修复完成后让玻片自然冷却，因为强制冷却会使得蛋白质难以恢复原有构型。
▶ 蛋白酶诱导的表位修复（PIER）
蛋白酶诱导的表位修复作用机制是酶切割可能掩盖表位的肽段，常用蛋白酶 K、胰蛋白酶和胃蛋白酶等进行修复，PIER 方法由于可能破坏组织形态和目的抗原，且成功率较低，通常较少使用。
与比单克隆抗体相比，多克隆抗体能识别多个表位，即使不进行抗原修复，检测到抗原的可能性也很高。
单克隆一抗VS多克隆一抗
单克隆抗体由于其来源于单个B细胞，具有高亲和力和以及针对单个抗原表位的高特异性。单抗在抗原能够保持天然构象的时候结合效果最好，一旦抗原构象发生改变，其结合效果就会大打折扣。因此单抗与抗原的结合容易受到温度、pH、固定、盐浓度以及翻译后修饰、蛋白质相互作用等因素的干扰。
多克隆抗体可识别多个表位，因此它们较少受到蛋白构象变化的影响。通常多克隆抗体对pH变化和盐浓度影响下的稳定性也比单克隆抗体更好。因此在IHC/ICC实验中更多的选择多克隆抗体。
直接检测VS间接检测
高表达的抗原一般可以通过直接检测来实现。直接检测不受二抗非特异性结合的干扰，在进行多色检测的时候操作更加简单。但是检测的灵敏度有限，对于低表达的抗原无能为力，因此该方法的运用受到抗原丰度的限制。
间接检测方法通过每一个一抗与至少两个二抗结合来放大检测信号，因此检测限更低，能够产生更强的信号。但是由于需要结合二抗而增加了封闭和对照。
最常见的生物素—亲和素系统（Biotin-Avidin—System，BAS）几乎可与目前研究成功的各种标记物结合。生物素与亲和素之间高亲合力的牢固结合以及多级放大效应，使BAS免疫标记和有关示踪分析更加灵敏。目前广泛用于微量抗原、抗体定性、定量检测及定位观察研究。链霉亲和素与亲和素一样，每一分子能结合4分子生物素，同时链霉亲和素不带任何糖基，避免了项亲和素一样与细胞表面的多糖发生非特异结合。因此采用生物素化二抗与亲和素或链霉亲和素孵育可以明显放大信号。
荧光检测VS显色检测
▶ 荧光检测
荧光检测是基于荧光色素的使用，它们在受到较短波长的光激发时发光。荧光色素可直接与一抗或二抗结合，或与链霉亲和素结合。免疫荧光常用于多个细胞目标的同时观察。例如，组织可与不同的一抗混合物孵育，再与结合有荧光色素的二抗孵育，这些荧光染料在不同波长下发光。
多色实验必须经过设计，以限制检测试剂之间的交叉反应性，以及所使用的荧光染料在光谱性质上的交叉。为了限制二抗之间的交叉反应性，一抗应来自不同的物种。这样就能使用物种特异的二抗，分别只识别一个一抗。
▶ 显色检测
为了方便显色检测，一抗、二抗或链霉亲和素可与酶结合。在加入可溶的有机底物时，酶与底物反应，产生不溶的有色产物，沉积在抗原表达的位置。常用的酶包括辣根过氧化物酶 (HRP) 和碱性磷酸酶 (AP)，它们分别将 3,3'二氨基联苯胺 (DAB) 和 3-氨基-9-乙基咔唑 (AEC) 转化成棕色和红色的终产物。DAB 比 AEC 更常用，因为后者易溶于酒精，且暴露在过度光照下时更容易褪色。在使用 AEC 时必须用水性的复染剂和封片剂。
通常认为显色检测比免疫荧光更为灵敏，但没那么方便，因为孵育和封闭步骤更多。与免疫荧光相似，显色检测也允许多个抗原的观察，但这些抗原只能在细胞和组织的不同位置，因为重叠的颜色可能会使结果难以解释。
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