理论上使用公认选择的亲和纯化抗体可得到高特异性，高敏感度的免疫测定。然而，由于经济原因或是缺乏合适的试剂，使得许多工作者采用低纯度的制品，这种试剂通常含有与试验中其它成分起交叉反应的抗体。现已发现在用抗人IgG抗血清的抗体时，抗体中含有不需要的抗体交叉反应。但当使用亲和纯的抗血清时，交叉反应不明显。研究任何ELISA系统，为了控制不需要的交叉反应，就要不惜使用亲和纯试剂。使用抗IgG血清抗体作为包被抗体，有时本底确实很低，但它的敏感度比仅使用亲和纯制品要低50-100倍。在高敏感度的实验中应用封闭试剂是很重要的。最终选择非亲和纯抗IgG血清抗体是基于这样设想：包被抗体或是结合的人IgG（抗原）与指示抗体有交叉反应，则过量的与指示抗体同种动物的血清，就可以封闭与酶标抗体的不要的结合。然而人血清白蛋白中含有少量的IgA和IgG会干扰检测。人血清白蛋白只适用于IgE的测定。同样，不能用牛血清白蛋白。因为其中含有微量的牛IgG。
抗血清抗体与亲和纯抗体对ELISA夹心法结果的影响可从下面实验看出。
实验a：包被抗体为粗制的绵羊抗人IgG抗体，指示抗体（检抗）为粗制山羊抗人IgG抗体
实验b：包被抗体为亲和纯的绵羊抗人IgG抗体，指示抗体（检抗）为粗制山羊抗人IgG抗体
实验c：包被抗体为粗制的绵羊抗人IgG抗体，指示抗体为亲和纯的山羊抗人IgG抗体
实验d：包被抗体和指示抗体都是亲和纯的兔抗人IgG抗体。
实验中使用5%血清（与指示抗体同物种来源）进行封闭，其他夹心法ELISA步骤相同。
结果显示，当粗制的抗IgG血清抗体被用在夹心法的两端（如实验a曲线）时，本底很高且曲线坡度不明显。虽然能成功应用此抗体类型，但问题是一种抗体结合另一种抗体。可能发生了山羊指示抗体结合了绵羊包被抗体，因为稀释液中的山羊血清过剩也不能降低本底值。
当应用亲和纯化的包被抗体时（如实验b曲线），本底适当降低而且形成了标准曲线。然而，大多数工作者认为本底仍偏高，工作范围有限（2-60ng/ml）。当亲和纯的指示抗体与粗制包被抗体联合使用时（如实验c曲线），本底大大较低，但敏感度约为100-200ng/ml，再者工作范围仍受限。当完全使用亲和纯的抗体时（如实验d曲线），本底低，敏感度大大改善且工作范围广（2-500ng/ml）。
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