YIJI基质金属蛋白酶（MMP）明胶酶谱法电泳分析试剂盒使用说明
主要用途
YIJI基质金属蛋白酶（MMP）明胶酶谱法（gelatin-zymography）电泳分析试剂是一种旨在通过明胶聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法，在分离、蛋白复性、底物水解、染色等一系列步骤下，观察并半定量深蓝色背景中的无色清晰的基质金属蛋白酶条带，根据分子量确定特异基质金属蛋白酶及其活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种细胞萃取样品（动物、人体、植物、昆虫等）、培养上清悬液、血清和关节滑液或脑脊液等基质金属蛋白酶-2，9，以及13等活性及其抑制剂的检测。产品即到即用，性能稳定，操作便捷，敏感度高，条带清晰，重复性好。
技术背景
基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinases；MMPs）是一类结构高度同源的分泌型或膜相关性锌内肽酶的总称，因含有金属（锌、钙）离子而得名。其功能在于分解细胞外基质成分。迄今为止发现的MMPs至少有28种，几乎能降解除多糖以外的全部细胞外基质（extracellular matrix）成分，同时参与胚胎发育、形态形成、胚泡植入（blastocyst）、血管形成、组织再吸收（tissue resorption）、疾病发生，例如关节炎、癌细胞浸入转移等。根据降解的底物不同可将MMPs分为4大类：（1）胶原酶：MMP1、MMP8、MMP13主要消化Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅶ、Ⅹ型胶原和蛋白多糖；（2）明胶酶（Ⅳ型胶原酶）：MMP2、MMP9，又称明胶酶A、B，主要消化Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ型胶原和弹性纤维；（3）基质溶解素：MMP3、MMP7、MMP16、MMP11，主要作用于纤维粘连蛋白、层粘连蛋白、弹力纤维、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅸ胶原及MMP1、MMP8、MMP9；（4）膜型金属蛋白酶：MT1-MMP、MT2-MMP、MT3-MMP，主要作用于明胶、Ⅳ型胶原、MMP2。体内绝大多数细胞并不储备MMPs，当需要MMPs的信号传递到细胞后才临时合成，合成的MMPs以无活性的酶原（proenzyme）形式分泌到细胞外，随后被多种蛋白酶和非蛋白酶水解以及热处理激活，一种激活的MMPs可激活另一种MMPs，形成瀑布效应。明胶酶谱法（gelatin-zymography）电泳分析技术具有简便，无需抗体，同步观察多种酶以及活化与否的优势
产品内容
YIJI胶体液（Reagent A） 100毫升
YIJI凝结液（Reagent B） 3毫升
YIJI促进液（Reagent C） 500微升
YIJI胶顶液（Reagent D） 25毫升
YIJI电泳液（Reagent E） 250毫升
YIJI上样液（Reagent F） 1毫升
YIJI复性液（Reagent G） 50毫升
YIJI消化液（Reagent H） 50毫升
YIJI染色液（Reagent I） 250毫升
YIJI祛色液（Reagent J） 250毫升
YIJI终止液（Reagent K） 250毫升
产品说明书 1份
保存方式
保存YIJI凝结液（Reagent B）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里； YIJI胶体液（Reagent
A）、YIJI促进液（Reagent C）、YIJI胶顶液（Reagent D）、YIJI上样液（Reagent
F）、YIJI染色液（Reagent I），避免光照，有效保证6月
用户自备
无离子水：用于稀释浓缩型试剂溶液
1.5毫升离心管：用于样品处理的容器
15毫升锥形离心管：用于胶体溶液配制的容器
50毫升锥形离心管：用于胶体溶液配制的容器
培养箱：用于孵育反应物
电泳仪：用于蛋白样品电泳分离
平式摇荡仪：用于孵育和混匀反应
实验步骤
实验开始前，移取50毫升YIJI电泳液（Reagent E）到500毫升容器里，加入450毫升用户自备的无离子水，混匀后，标记为YIJI电泳工作液。同时将YIJI胶体液（Reagent A）、YIJI凝结液（Reagent B）、YIJI促进液（Reagent C）和YIJI胶顶液（Reagent D）放进25℃恒温水槽预热。然后进行下列操作。
移出20毫升YIJI胶体液（Reagent A）到50毫升锥形离心管里
加入400微升YIJI凝结液（Reagent B）
加入40微升YIJI促进液（Reagent C）（注意：如果凝结过快，可以适量减少YIJI凝结液（Reagent B）和YIJI促进液（Reagent C））
混匀后，即刻移入玻璃槽，避免气泡
在室温下孵育45分钟，或直至胶体凝结
移出5毫升YIJI胶顶液（Reagent D）到15毫升锥形离心管里
加入100微升YIJI凝结液（Reagent B）
加入10微升YIJI促进液（Reagent C）（注意：如果凝结过快，可以适量减少YIJI凝结液（Reagent B）和YIJI促进液（Reagent C））
混匀后，即刻移入玻璃槽，避免气泡
插入0.75毫米厚的10孔梳
在室温下孵育45分钟，或直至胶体凝结
将玻璃槽移入到电泳槽里
加入适量的含有YIJI电泳液（Reagent E）的YIJI电泳工作液
小心拔去10孔梳
用吸管或1毫升枪头冲洗样品孔备用
从－70℃冰箱里取出待测样品（注意：样品须澄清；参见注意事项3）
移取10微升样品（20微克总量）到1.5毫升离心管
加入10微升YIJI上样液（Reagent F），混匀
室温下静置10分钟
小心移取20微升样品到玻璃槽的样品孔里（包括用户自备的蛋白标准样）
电泳运行1至2小时，电压为125伏，直至染料前沿到达胶底处
关闭电源，取出玻璃板，小心拆开，避免损坏胶体
放进塑料盒
加入90毫升用户自备的无离子水到塑料盒里
加入10毫升YIJI复性液（Reagent G）
室温下，平放在平式摇荡仪上孵育1小时，速度为50RPM
小心倒掉复性液
加入90毫升用户自备的无离子水到塑料盒里
加入10毫升YIJI消化液（Reagent H）
放进37℃培养箱里，在平式摇荡仪上孵育20小时，速度为50RPM（注意：如果酶活性过低，可以延长孵育时间至40小时）
小心倒掉消化液
加入50毫升用户自备的无离子水到塑料盒里
加入50毫升YIJI染色液（Reagent I），混匀
室温下，平放在平式摇荡仪上孵育60分钟，速度为50RPM
小心倒掉染色液
加入50毫升用户自备的无离子水到塑料盒里
加入50毫升YIJI祛色液（Reagent J），混匀
室温下，平放在平式摇荡仪上孵育30分钟，速度为50RPM，或直至可见蓝色背景下白色清晰的条带（注意：避免过度去色）
小心倒掉祛色液
加入50毫升YIJI终止液（Reagent K）
进行拍照记录或成像仪处理和半定量分析：
基质金属蛋白酶 | 阳性条带位置 | 说明 |
MMP-2 | 72 Kd | 无活性的酶（proenzyme/latent） |
MMP-2 | 62 Kd（或67 Kd） | 活化的酶（active） |
MMP-9 | 92 Kd | 无活性的酶原（proenzyme/latent） |
MMP-9 | 82 Kd（或84 Kd） | 活化的酶（active） |
注意事项
本产品为5次（45个样品）操作
操作时，须戴手套
样品准备要点如下：
必须澄清，至关重要：4℃高速离心5分钟，速度为10000g，置于－70℃保存待测
样品中避免使用EDTA、EGTA等二价阳离子鳌和剂以及巯基乙醇和DTT等
样品中避免使用硫醇抑制剂（THIOL INHIBITOR）
由于TIMP等天然抑制剂的存在，血清样品中的基质金属蛋白酶活性很低，可以使用活化剂（建议使用YIJI胶原酶潜酶活化剂（APMA）－YIJI12197）
如果验证样品中基质金属蛋白酶，可以使用抑制剂EDTA对照
避免培养细胞上清样品显示黄色，表明已经过于酸性，须调整pH为中性方可使用
胶体和胶顶配制前，须25℃预热相关试剂
电泳前注意清洗样品孔
电泳运行，注意安全
染色时，避免光照
染色后显示的亮带PRO－MMP9（92Kd）、浅带MMP9（82Kd）、亮带PRO－MMP2（72Kd）、亮带MMP2（62Kd）的条带：在深蓝色背景下的白色条带
有时会出现多条带（multiple bands），表明酶的降解产物
本公司提供系列基质金属蛋白酶酶谱检测试剂产品
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