主要用途
真菌/酵母细胞线粒体DNA萃取试剂是一种旨在使用生物、化学和物理方法相结合，有效去除真菌/酵母菌细胞壁，进一步快速且充分裂解真菌/酵母菌细胞，从而分离出完整而纯化的线粒体细胞器，然后进一步生物酶处理以获得高质量的线粒体DNA的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。适合于各种新鲜培养或冻存的野生型或突变型真菌/酵母菌菌株细胞的线粒体核酸成分的分离。用于后续的杂交、克隆、酶切、PCR分析等。产品即到即用，操作简易，性能稳定，无核酶污染，萃取纯度和产量皆高。
技术背景
线粒体细胞器的研究是现代细胞生物学的最重要的课题之一。线粒体成为生物衰老、古生物、细胞凋亡等研究的主要对象。线粒体DNA的分离和定量以及突变分析是研究中必不可少的。
产品内容
清理液（Reagent A） 500毫升
平衡液（Reagent B） 500毫升
酶解液I（Reagent C） 1毫升
裂解液（Reagent D） 80毫升
净化液（Reagent E） 20毫升
强化液（Reagent F） 10毫升
保存液（Reagent G） 200毫升
破膜液（Reagent H） 6毫升
去干扰液（Reagent I） 600微升
酶解液II（Reagent J） 600微升
萃取液（Reagent K） 6毫升
浓缩液（Reagent L） 2毫升
助沉液（Reagent M） 20微升
沉淀液（Reagent N） 20毫升
纯化液（Reagent O） 20毫升
缓冲液（Reagent P） 1毫升
产品说明书 1份
保存方式
保存酶解液I（Reagent C）和净化液（Reagent E）、去干扰液（Reagent I）、酶解液II（Reagent
J）、萃取液（Reagent K）和助沉液（Reagent M）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里，严格避免污染，有效保证6月
用户自备
15毫升锥形离心管：用于线粒体初步制备物的存放
50毫升锥形离心管：用于细胞收集后离心或清洗
1.5毫升离心管：用于保存线粒体
4℃台式离心机：用于沉淀细胞
4℃台式高速离心机：用于分离细胞器成分
微型台式离心机：用于沉淀核酸
涡旋震荡仪：用于混匀
恒温水槽：用于孵育反应物
DOUNCE匀浆器：用于裂解细胞
实验步骤
实验开始前，将试剂盒里的净化液（Reagent E）冻融，然后移出1毫升净化液（Reagent E）到4毫升的裂解液（Reagent D）里，混匀后，置入冰槽里，标记为裂解工作液。然后进行下列操作。
准备好50毫升新鲜真菌/酵母菌样品
在分光光度仪上测OD600＝1.0（1 OD＝1 X 107细胞/毫升；总量为5 X 108细胞）
转移到预冷的50毫升锥形离心管
放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为3000g
小心抽去上清液
加入25毫升清理液（Reagent A），混匀
放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为3000g
小心抽去上清液
加入5毫升平衡液（Reagent B），混匀
放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为3000g
小心抽去上清液
加入2毫升平衡液（Reagent B），混匀
加入50微升酶解液I（Reagent C），混匀
放进30℃恒温水槽孵育60分钟，期间每隔15分钟轻轻用手摇匀
加入5毫升平衡液（Reagent B），混匀
放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为3000g
小心抽去上清液
加入5毫升平衡液（Reagent B），混匀
放进30℃恒温水槽孵育30分钟，继续实验步骤21
同时将平衡液（Reagent B）置入冰槽里预冷30分钟（注意：以下步骤在4℃环境下进行）
放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为3000g
小心抽去上清液
加入5毫升预冷的平衡液（Reagent B），混匀
放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为3000g
小心抽去上清液
加入5毫升含有裂解液（Reagent D）和净化液（Reagent E）的裂解工作液
涡旋震荡5秒，充分混匀细胞颗粒群
选择下列其中一种方法：
方法一：物理处理法
即刻放进预冷的DOUNCE匀浆器
在冰槽里用匀浆棒匀化细胞（约80下）（注意：参见注意事项10）
将所有细胞匀浆物移入15毫升锥形离心管
放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为1500g
小心移出上清液到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管——此步骤去除细胞核和未溶解的细胞
放进4℃台式高速离心机离心10分钟，速度为10000g
小心抽去上清液，保留沉淀颗粒——此步骤获得线粒体沉淀物（注意：如果暂时停止操作，须暂时放进－70℃冰箱里）
加入300微升破膜液（Reagent H）到线粒体颗粒样品中
涡旋震荡15秒，混匀颗粒群
转入1.5毫升离心管
置入冰槽中孵育15分钟
加入30微升去干扰液（Reagent I）
用200微升枪头上下抽吸混匀
放进37℃恒温水槽孵育15分钟
加入30微升酶解液II（Reagent J）
涡旋震荡15秒
放进58℃恒温水槽或干式培养仪孵育2小时（注意：可以孵育4至16小时，增加萃取产量）
置于室温下冷却15分钟，直至处于室温状态（或置于冰槽里15至30秒）
加入300微升萃取液（Reagent K）（注意：使用前摇匀）
涡旋震荡5秒
放进微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
移出上层液相溶液到新的1.5毫升离心管（注意：切莫触碰液相交界面上的白色膜状物）
加入100微升浓缩液（Reagent L）到新的离心管
加入1微升助沉液（Reagent M）
加入800微升沉淀液（Reagent N）
在涡旋震荡仪上震荡5秒，充分混匀
放进微型台式离心机离心15分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）（注意：离心前做好方位标记，以便离心后观察管底沉淀颗粒）
小心抽掉上清液
加入1毫升纯化液（Reagent O）
放进微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
小心抽掉上清液
空气中晾干沉淀颗粒群
加入20微升缓冲液（Reagent O）
溶解后放进－20℃冰箱长期保存或移出2微升进行PCR反应
方法二：化学处理法
在冰槽里孵育2分钟，期间涡旋震荡5秒一次
加入500微升预冷的强化液（Reagent F）
涡旋震荡5秒，充分混匀
在冰槽里孵育5分钟，期间涡旋震荡5秒二次（注意：参见注意事项11）
加入5毫升预冷的保存液（Reagent G），轻轻摇动试管混匀
放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为1500g
小心移出上清液到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管——此步骤去除细胞核和未溶解的细胞
放进4℃台式高速离心机离心10分钟，速度为10000g
小心抽去上清液，保留沉淀颗粒——此步骤获得线粒体沉淀物（注意：如果暂时停止操作，须暂时放进－70℃冰箱里）
加入300微升破膜液（Reagent H）到线粒体颗粒样品中
涡旋震荡15秒，混匀颗粒群
转入1.5毫升离心管
置入冰槽中孵育15分钟
加入30微升去干扰液（Reagent I）
用200微升枪头上下抽吸混匀
放进37℃恒温水槽孵育15分钟
加入30微升酶解液II（Reagent J）
涡旋震荡15秒
放进58℃恒温水槽或干式培养仪孵育2小时（注意：可以孵育4至16小时，增加萃取产量）
置于室温下冷却15分钟，直至处于室温状态（或置于冰槽里15至30秒）
加入300微升萃取液（Reagent K）（注意：使用前摇匀）
涡旋震荡5秒
放进微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
移出上层液相溶液到新的1.5毫升离心管（注意：切莫触碰液相交界面上的白色膜状物）
加入100微升浓缩液（Reagent L）到新的离心管
加入1微升助沉液（Reagent M）
加入800微升沉淀液（Reagent N）
在涡旋震荡仪上震荡5秒，充分混匀
放进微型台式离心机离心15分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）（注意：离心前做好方位标记，以便离心后观察管底沉淀颗粒）
小心抽掉上清液
加入1毫升纯化液（Reagent O）
放进微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
小心抽掉上清液
空气中晾干沉淀颗粒群
加入20微升缓冲液（Reagent P）
溶解后放进－20℃冰箱长期保存或移出2微升进行PCR反应
注意事项
本产品为20次操作（50毫升菌液：1克细胞湿重或5 X 108细胞）
其它实际操作的细胞量与试剂使用量按比例调整：例如10毫升菌液（OD600=1）：试剂用量是标准用量的五分之一
操作时，须戴手套
整个操作须无菌操作，严格避免污染母液
50毫升（OD600＝1）菌液湿重约1克
细胞生长条件影响线粒体的质量：建议在有氧条件下富含葡萄糖的培养基培养
线粒体操作均须在4℃或以下状态下进行
建议使用足够的细胞量
建议严格控制操作时间
通常匀化次数为80下（或细胞颗粒群消失为止）达到80％的细胞裂解为理想状态，但不同菌株的细胞会存在差异。用户可以通过显微镜观察3微升匀浆物的细胞裂解程度：完整细胞呈现发亮的圆环。低于50％可以增加匀化次数
通常孵育5分钟达到80％的细胞裂解为理想状态，但不同菌株的细胞会存在差异。用户可以通过显微镜观察3微升裂解物的细胞裂解程度：完整细胞呈现发亮的圆环。低于50％可以增加孵育时间和涡旋震荡次数
对于难以裂解的细胞，采用物理匀浆法是优先推荐的技术处理
试剂中的溶液使用前摇匀；酶解液II（Reagent J）需放进37℃温育少许；为避免反复冻融，建议适量分装
可以通过增加线粒体溶解时间（30分钟）和酶解时间（直至16小时），获得大量的DNA产量
通常1克真菌/酵母细胞湿重或5 X 108真菌/酵母细胞提取的线粒体DNA达10至20微克，但不同菌株或培养条件会存在差异
16．本产品所获得的线粒体DNA纯度和产量最为理想，确保无核DNA和外源性DNA污染
本公司提供系列真菌/酵母细胞线粒体试剂产品
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