细菌ATP/ADP/AMP含量高效液相色谱法（HPLC）定量检测试剂...

细菌ATP/ADP/AMP含量高效液相色谱法（HPLC）定量检测试剂盒使用说明

产品说明书（中文版）

主要用途

细菌ATP/ADP/AMP含量高效液相色谱法（HPLC）定量检测试剂是一种旨在通过高氯酸酸性处理，碱性中和后，在高效液相色谱仪和紫外光度仪下（254nm波长）检测分析，分离出ATP、ADP或AMP波峰，以定量测定样品中腺嘌呤核苷酸含量的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种细菌样品中ATP、ADP、AMP的含量检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。

技术背景

腺嘌呤核苷酸（adenine nucleotides），简称腺苷，包括单磷酸腺苷、二磷酸腺苷和三磷酸腺苷，是一种单体单位，为核糖核酸（RNA）和脱氧核糖核酸（DNA）的组成成分，并提供化学能量，在能量代谢通路中维护诸如肌肉、胞膜等组织细胞结构的生化和生理功能，调节细胞糖酵解、三羧酸循环、电子传递系统、氧化磷酸化活动。腺嘌呤核苷酸在细胞中浓度低，且不稳定，通常通过其类型不同、浓度差异、分布状况，来评价细胞的代谢情况和能量状态。单磷酸腺苷（Adenosine monophosphate；AMP），又称为5'-腺嘌呤核苷酸或腺苷酸（5'-adenylic acid），是一种在（脱氧）核糖核酸中发现的核苷酸。它是一种磷酸及核苷腺苷的酯，并由磷酸基团、戊糖核酸糖及碱基腺嘌呤所组成。分子式为C10H14N5O7P，分子量347。AMP可以通过腺苷酸激酶（adenylate kinase）催化2分子ADP生成，或通过ATP以及ADP水解产生。AMP常以腺苷-3',5'-环化一磷酸（cAMP）形式存在于细胞中。AMP与ATP之比反映细胞ATP生成状况以及脂肪酸氧化程度。二磷酸腺苷（adenosine diphosphate；ADP），参与ADP-ATP循环，提供热能转换和动态平衡。三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate；ATP）存在于所有代谢活跃的细胞内，是细胞活力的标志。一旦细胞凋亡或坏死，ATP浓度急遽下降。通过高氯酸酸性处理，排除蛋白质干扰，碱性中和后，在高效液相色谱仪和紫外光度仪下（254nm波长）检测分析，分离出ATP、ADP、AMP波峰，以定量其含量。 

产品内容

酸性液（Reagent A）        5毫升

中和液（Reagent B）     1毫升

流相液A（Reagent C）      500毫升

流相液B（Reagent D）      500毫升

标准液（Reagent E）      500微升

产品说明书      1份

保存方式

保存标准液（Reagent E）在-20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；酸性液（Reagent A）和中和液（Reagent B）具有腐蚀性，注意操作安全；有效保证6月

用户自备

1.5毫升离心管：用于样品操作的容器

4℃（微型）台式离心机：用于样品操作

高效液相色谱仪（HPLC）：用于定量测定

实验步骤

样品准备 

• 准备好待测细菌样品 

• 进行细菌计数：在分光光度仪上测定OD600或直接计数

• 转移到预冷的1.5毫升离心管

• 放进4℃微型台式离心机离心5分钟，速度为10000g（或10000RPM，例如eppendorf 5415）

• 小心抽去上清液，保留沉淀颗粒

• 加入200微升预冷的酸性液（Reagent A）

• 涡旋震荡1分钟

• 转移到1.5毫升离心管

• 放进4℃微型台式离心机再次离心10分钟，速度为6000g

• 小心移取上清液到新的1.5毫升离心管

• 加入31微升中和液（Reagent B），充分混匀

• 置于冰槽里静置30分钟

• 即刻移入上清液到新的1.5毫升离心管（注意：避免移取沉淀颗粒）

• 放进－70℃冰箱里保存或置于冰槽里待测
  

二、测定准备

• 开启仪器预热15分钟

• 根据下表设置高效液相色谱仪（HPLC）参数
  

• 运行程序

标准样品配制

• 准备好5个1.5毫升离心管，标记为1至5号管

• 分别加入100微升流相液A（Reagent C）到1至5号管

• 移取100微升标准液（Reagent E）到1号管，混匀

• 小心移取100微升1号管稀释的标准液（Reagent E）到2号管，混匀

• 小心移取100微升2号管稀释的标准液（Reagent E）到3号管，混匀

• 小心移取100微升3号管稀释的标准液（Reagent E）到4号管，混匀

• 将1至5号管放进冰槽里备用，避免光照；标准管浓度见下表

四、色谱分析

• 将上述配制的标准液（Reagent E）和待测样品放进冰槽里等待

• 每次（每个样品）注射50微升

• 按照检测运行程序每次（每个样品）运行15分钟

• 获得色谱波峰图：波峰面积（peak area）或峰值，保存记录
  

五、计算样本ATP/ADP/AMP浓度

• 方法一：通过仪器中的软件进行测算

• 方法二：构建标准曲线：纵座标（Y轴）为波峰面积（peak area）；横座标（X轴）为标准ATP/ADP/AMP浓度（微摩尔/升），根据标准曲线获得样品对应ATP/ADP/AMP浓度（微摩尔/升）

• 方法三：公式计算（选择单一浓度的标准液）

样本ATP/ADP/AMP浓度（微摩尔/升）=【样本波峰面积（peak area）X标准ATP/ADP/AMP浓度】÷对应标准ATP/ADP/AMP浓度的波峰面积

注意事项

• 本产品为25次操作，包括标准液

• 操作时，须戴手套

• 系统操作过程中，标准液测定只需1次

• 试剂具有挥发性，注意密闭瓶盖或使用封口膜

• 酸性液（Reagent A）和中和液（Reagent B）具有腐蚀性，注意操作安全

• 建议使用流相液A（Reagent C）作为阴性对照或作为基准线

• 色谱柱的异物残留、气泡产生、温度未达均衡等将导致异常波峰、时间偏移等

• 用户可以使用已知浓度的标准液（Reagent E）作为内参标准加入到样品中，然后进行萃取，检测回收率（recovery）

• 腺嘌呤核苷酸的出峰时间（retention）以用户操作时，使用的标准液（Reagent E）实际出峰为准

• 用户可以根据要求，计算实际浓度为：纳摩尔/毫升、纳摩尔/毫克蛋白等 

• 如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度

• 腺嘌呤核苷酸HPLC的参考图谱如下：  

• 本公司提供系列腺嘌呤核苷酸检测试剂产品

质量标准

• 本产品经鉴定性能稳定

• 本产品经鉴定检测敏感