简介
PowerFecal™ DNA Isolation kit 专门设计用于简便快速粪便、肠内容物、生物固体样品微生物和宿主总 DNA。基于 PowerSoil™ DNA Isolation Kit 开发,使用了无论对土壤还是粪便样品同样奏效的ZL抑制因子去除技术(Inhibitor Removal Technology®)。IRT 技术能高效去除常见于粪便样品的多糖、亚铁血红素和胆汁盐等抑制因子。纯净的最终 DNA 可直接用于所有下游实验。
操作预览
粪便或生物固体建议加样 0.25g。样品装入到含有石榴石研磨珠的独立 2ml Bead Beating Tube 中。在研磨珠的机械碰撞和化学试剂对细胞膜的破解作用促使下宿主、微生物细胞裂解,高效的提取效果足以应付最难搞的微生物类型。ZL的抑制因子去除技术(Inhibitor Removal Technology®)接着去掉粪便样品中常见的 PCR 抑制物。总基因组 DNA 吸附到硅胶滤膜上。经过冲洗和洗脱,纯净的最终 DNA 可直接用于 PCR、qPCR、第二代测序等进一步应用。
相关产品 | 货号 | 提取次数 |
PowerMax® Soil DNA Isolation Kit | 12988-10 | 10 preps |
PowerSoil®-htp 96 Well Soil DNA Isolation Kit | 12955-4 | 4×96 preps |
12988-12 | 12×96 preps | |
PowerVac™ Manifold | 11991 | 1 manifold |
PowerVac™ Mini System | 11992 | 1 unit + 20 adapters |
PowerVac™ Mini Spin Filter Adapters | 11992-10 | 10 adapters |
11992-20 | 20 adapters |
设备要求
微型离心机(13000g)
移液器(60μl – 750μl)
Vortex-Genie®2 涡旋仪(MO BIO 货号#13111-V-220)涡旋仪适配器(MO BIO 货号#13000-V1-24)
保存:组分室温(15-30℃)保存。
试剂盒组分
货号:12830-50
组分 | 量 |
Dry Bead Tubes | 50 |
Bead Solution | 42ml |
Solution C1 | 3.3ml |
Solution C2 | 14ml |
Solution C3 | 11ml |
Solution C4 | 72ml |
Solution C5 | 30ml |
Solution C6 | 6ml |
Spin Filters(units in 2ml Tubes) | 50 |
2 ml Collection Tubes | 200 |
△实验前请先逐一检查试剂!
保存:组分室温(15-30℃)保存。
操作步骤
1、加入 0.25g 粪便或生物固体到 Dry Bead Tube 中。
注意:水分、多糖和蛋白含量较高的粪便样品(如胎便、某些鸟类粪便)减少加样量(0.1g)能提高 DNA 得率和纯度。
2、加入 750μl Bead Solution 到 Dry Bead Tube 中。轻轻涡旋混匀。
这一步发生了什么:把样品加入到 Bead Tube 后,下一步就是样品均质化和细胞裂解。石榴石研磨珠和裂解裂解缓冲液可溶解和把样品分散开。
3、使用前先检查 C1 溶液。若有沉淀,60℃水浴直至全部溶解。
这一步发生了什么:C1 溶液含有 SDS。温度较低时会在瓶底形成白色沉淀。60℃水浴可重新溶解 SDS,并且对SDS 和其它组分性能无损。可趁热使用。
4、加入 60μl C1 溶液,上下颠倒数次或轻轻涡旋混匀。
这一步发生了什么:C1 溶液含有 SDS 和其它裂解试剂可辅助细胞裂解。SDS 是种去垢剂,可降解细胞膜上的脂肪酸和油脂。
5、65℃水浴加热 10min。
这一步发生了什么:粪便样品杂合了许多多糖、脂类、盐和细胞等。加热可加快裂解缓冲液与这些物质的反应速度,辅助裂解细胞。
6、把 Bead Tubes 水平放置到涡旋仪适配器上(MOBIO 货号:13000-V1-24)。最大转速连续涡旋振荡 10min。
这一步发生了什么:研磨珠与微生物细胞在裂解试剂包围下震荡,可使细胞破裂。MOBIO 的涡旋仪适配器是个简单而有效的附件,在涡旋振荡过程中能把
Tube 管牢牢卡在涡旋仪上。你也可以用胶带把 Tube 管固定在适配器上,但有可能在振荡过程中松脱,影响样品间条件一致性,降低得率。
7、13000g 离心 1min。
8、把上清转移到一个干净的 2ml Collection Tube(试剂盒提供)中。约可获得 400-500μl 上清。
这一步发生了什么:这一步约可获得 400-500μl 上清液。预期的体积与样品起始量有关,不影响提取效率。
9、加入 250μl C2 溶液,轻轻涡旋混匀。4℃孵育 5min。
这一步发生了什么:C2 溶液为ZL的 Inhibitor Removal Technology®(IRT)的一部分。它含有可沉淀多糖、细胞碎片和蛋白质等非 DNA 的有机和无机物质的试剂。这些有机和无机物质会影响 DNA 纯度并抑制下游实验,必须去除。
10、13000g 离心 1min。
11、避开沉淀,最多只转移 600μl 上清到一个干净的 2ml Collection Tube(试剂盒提供)中。
这一步发生了什么:沉淀为多糖、细胞碎片、蛋白等非 DNA 有机和无机成分。为获得最佳 DNA 得率和质量,转移上清时避开沉淀。
12、加入 200μl C3 溶液,轻轻涡旋。4℃孵育 5min。13、13000g 离心 1min。
14、避开沉淀,转移上清到一个干净的 2ml Collection Tube(试剂盒提供)中。转移的上清液不能超过 750μl。
这一步发生了什么:沉淀为多糖、细胞碎片、蛋白等非 DNA 有机和无机成分。为获得最佳 DNA 得率和质量,转移上清时避开沉淀。转移的上清不能超过 750μl,否则会影响后续 DNA 的吸附绑定。
15、C4 溶液使用前先摇匀。加入 1200μl C4 溶液到上清中,涡旋 5s 混匀。
这一步发生了什么:C4 溶液为高浓度盐溶液。可让 DNA 牢牢地选择性吸附到硅胶滤膜上,非 DNA 的有机和无机物质不被吸附,但仍会少量残留在滤膜上。
16、加载 650μl 上清到一个 Spin Filter 中,13000g 离心 1min。弃去滤液,重复加载上清。
注意:一共需要加载 3 次上清。
高通量选项:一次要处理大量样品时,步骤 16 会变得非常耗时。因此 MOBIO 开发出了真空泵抽吸法。需要额外购买真空泵适配器(MOBIO 货号:11992)。平底 Spin filter 在真空泵适配器帮助下能快速完成滤过动作。
这一步发生了什么:DNA 在高浓度盐环境下选择性地吸附到离心柱硅胶滤膜上。杂质通过滤膜,剩下 DNA 留在滤膜上。
17、加入 500μl C5 溶液,13000g 离心 1min。
这一步发生了什么:C5 是含有酒精的冲洗缓冲液,可进一步冲洗离心柱硅胶滤膜上的 DNA。冲洗缓冲液还能去除硅滤膜上残留的少量含和其它杂质。
18、弃去滤液。
这一步发生了什么:滤液不含 DNA。
19、13000g 再次离心 1min。
这一步发生了什么:再次离心去除残留的 C5 溶液(含有酒精的冲洗缓冲液)。含有酒精的 C5 溶液必须全部去除掉,以免影响后续 PCR、消化、凝胶电泳等 DNA 应用。
20、小心把 Spin Filter 转移到一个干净的 2ml Collection Tube(试剂盒提供)中。避免沾到任何 C5 溶液。
21、加入 100μl C6 溶液到离心柱白色滤膜中心。你也可以用灭菌 DNA-Free PCR 级纯水或 TE 缓冲液从硅胶离心柱上洗脱 DNA。
注意:用 100μl C6 溶液可获得最佳的 DNA 得率。为了浓缩 DNA,C6 溶液使用量最少可以只加 50μl。C6 溶液用量少于 50μl 会严重影响洗脱效率。
这一步发生了什么:把 C6 溶液(灭菌洗脱缓冲液)加到离心柱白色滤膜中心,并润湿整个滤膜才能获得最佳洗脱效果。C6 溶液(洗脱缓冲液)通过滤膜,DNA 在高浓度盐环境下选择性吸附到滤膜上,在 C6 溶液(10mM Tris)低盐环境下洗脱下来。
22、13000g 离心 1min,弃去 Spin Filter。此时 Tube 管中的 DNA 可直接用于下游实验,无需进一步处理。DNA建议-20℃~-80℃冷冻保存。C6 溶液不含 EDTA。要浓缩 DNA,可参考下文疑难点。
感谢选用 PowerFecal™ DNA Isolation Kit!
疑点难点
样品处理量
本试剂盒设计每次提取 0.25g 粪便样品。我们不推荐加样超过 0.25g。含有大量蛋白质、脂类和多糖的某些粪便样品,较少的加样量(0.1g)可提高 DNA 得率和纯度。
含水量较大的粪便样品
若粪便样品含有较多水分,可把样品加入到 Bead tube 以后,10000g 离心 30s。抽掉所有游离水分。接着步骤 2 继续。
若 DNA 扩增失败
通过凝胶电泳和分光光度法同时检测 DNA 得率。过浓的 DNA 模板会抑制 PCR 扩增。
使用 PowerFecal™ DNA Isolation Kit 提取的 DNA 通常不需要稀释模板 DNA,但也可一试。
若经过上述方法,DNA 仍扩增失败,请检查 PCR 反应体系(修改反应条件和重新选择引物)。
可选裂解方法
为减少 DNA 断裂: 加入 C1 溶液后,涡旋 3-4s,然后 70℃水浴 5min。涡旋 3-4s,再加热 5min。涡旋 3-4s。此可选处理方法能减少 DNA 断裂,但也会降低得率。
浓缩 DNA
最终 DNA 体积为 100μl。要浓缩 DNA 可加入 10μl 5M NaCl,上下颠倒 3-5 次混匀。然后加入 200μl 100%冷乙醇,上下颠倒 3-5 次混匀。室温 10000g 离心 5s。弃去所有上清。用真空离心蒸发器、干燥器或冷干机除去残余乙醇。用去离子水或灭菌 10mM Tirs 重悬 DNA。
DNA 保存
洗脱到 C6 溶液(10mM Tris)的 DNA 必须保存在-20℃~-80℃防止降解。为了延长保存时间,建议把 DNA 等分后-80℃保存。你也可以用 TE 缓冲液洗脱 DNA,而 EDTA 会抑制下游 PCR 等酶反应,不建议采用。