环状RNA—隐秘的未知RNA平行宇宙
环状RNA，被喻是隐秘的未知RNA平行宇宙。最近，复旦大学的郑秋鹏博士（2016交流会嘉宾之一）以第一作者身份在Nature Communications上发布了他们关于circHIPK3的最新研究成果。现在就和小编一起来学习circRNA的研究思路，认识圆圈重塑的RNA世界吧。
环状RNA测序的样本选择、分析方法
RNA测序分析来自6个正常组织（脑、结肠、心脏、肝、肺、胃）和7个癌症组织（膀胱尿路上皮癌、乳癌、结直肠癌、肝癌、胃癌、肾透明细胞癌、前列腺癌）的去核糖体RNA后的总RNA，发现了67,358个潜在的环状RNA，其中27,296含有至少两个unique back-spliced reads。
研究者使用RefSeq database 24对这些环状RNA进行注释；环状RNA表达差异使用Wilcoxon rank-sum test计算，比较癌症样本与相应正常组织样本。
初步鉴定预测的新环状RNA
为排除它们是线性的反式剪接产物，研究者检测了它们的物理特性。针对36个共同表达的待鉴定环状RNA转录本，设计了Outward-facing引物。每对引物分别扩增一个来自HEK-293T cDNA的不同产物。在RNase R处理后，全部36个back-spliced序列都明显存在。
选择哪个环状RNA继续下游功能研究呢？
通过锚点比对 (Anchor alignment)，根据它们的线性形式，给测序数据中每一个环状RNA进行丰度定量。研究者检测了它们的5’端和3’端成环比 (circular ratio，CR)，以5’ CR>0.2; 3’ CR>0.2; SRPBM>1为标准时，得到了990个高丰度表达的环状RNA。研究者留意到，这里面的其中一个环状RNA来自于HIPK3基因Exon2，命名为circHIPK3，丰度与back-spliced（反向剪接）比都很高。
多维尺度法筛选高丰度circRNA。红点和黑点分别表示高丰度和低丰度circRNA，circHIPK3以蓝点显示。灰色部分为筛选得的高丰度circRNA。
环状RNA研究第一步：鉴定环状
研究者使用outward-facing引物扩增出了预期大小的不同产物，并通过sanger测序确定了序列。环状的表达水平通过qRT-PCR检测，结果与RNA-seq一致，在多种组织里的表达量均高于其线性形式。
然后研究者检测了它在HeLa细胞中的稳定性和定位情况，用Actinomycin D（转录抑制剂）处理细胞后，环状RNA仍具有高稳定性，并能抵抗RNase R外切酶消化，表明它确实为环状形式。
e) qRT-PCR显示了circHIPK3和HIPK3 mRNA在HeLa细胞质或核。f) circHIPK3的RNA FISH实验。
circHIPK3是如何形成的？
HIPK3 Exon2两侧的外显子分析显示，高度互补Alu重复序列与28个短散在重复序列 (SINE) 处在HIPK3 Exon2上游的内含子中，51个SINE处于Exon3下游。研究者使用CRISPR/Cas9技术，去除了HEK-293T细胞中的circHIPK3侧翼Alu序列，结果发现下游Alu序列删除后，环化被抑制，但上游Alu删除后不仅没有减少circHIPK3的生成，还稍微增加了。
示意图显示基因组上HIPK Exon2区域含有侧翼Alu重复序列和长内含子。Alu元件和长内含子使用CRISPR/Cas9系统进行删除(gRNA1-6)。在gRNA两侧的引物用于检测删除效果(P1-5)
引物环状外显子的上游有许多Alu元件，研究者猜测内含子中有其他Alu元件可能促进环化，于是删除了上游大的内含子 (gRNA5、gRNA6)，结果circHIPK3显著下调，而HIPK3 mRNA没有变化，证明删除只影响back spilcing，而不影响典型的剪接，表明带Alu互补重复序列的侧翼长内含子，是circHIPK3生成所必需的。
使用4对gRNA把序列删除(gRNA3-6)，进行普通PCR和qRT-PCR，引物位点设计在删除区域外(P4+P5)
首页
