应用Target MS2 方法对大鼠血浆中人重组干扰素进行绝对定量的测试

1. 前言

随着蛋白质组学的不断发展，蛋白质组学已广泛深入到生物学研究的各个领域，目前，蛋白质组学研究已经由传统的大规模鉴定逐步转向了靶向蛋白质组学，研究内容已经由蛋白质鉴定扩展到了蛋白质相对和绝对定量，对复杂样本中蛋白质的相对与绝对定量有助于发现疾病的生物标志物，对于研究各类疾病的发生与发展有着重要的意义。

基于质谱的蛋白质组学定量方法主要有SILAC，TMT，iTRAQ 以及应用三重四级杆的MRM 等，本文主要介绍了赛默飞世尔新一代台式高分辨质谱仪Q-Exactive 在目标蛋白质定量方面的应用。结果显示Q-Exactive不仅可以在ng级上样量情况下达到98% 以上的蛋白质氨基酸序列匹配度，同时应用target ms2 方法，可以很好的对复杂样本中目标蛋白质进行绝对定量，其定量下限达到了amol，动态范围达到了6 个数量级，且线性相关系数在0.99 以上。

2. 实验部分

2.1 样品信息

人重组干扰素α-2b 标准品（浓度为1mg/ml），注射人重组干扰素α-2b 后的处理组大鼠血浆样本以及空白大鼠血浆样本。

2.2 实验流程

1. 使用Full MS/ddMS2 方法对人重组干扰素α-2b 标准品酶解的肽段进行鉴定，筛选其unique peptide；

2. 将人重组干扰素α-2b 标准品酶解肽段稀释成不同浓度的标准品，其浓度分别为104ng/ml，103ng/ml，102ng/ml，101ng/ml，100ng/ml，10-2ng/ml，并掺入至空白大鼠血浆样本酶解肽段中，分别上样18ul，使用Target MS2 方法根据其unique peptide 的fragment ion 峰面积，绘制标准曲线；

3. 处理组大鼠血浆酶解肽段上样18ul， 根据其unique peptide 的fragment ion 峰面积计算出大鼠血浆中人重组干扰素α-2b 的浓度。

2.3 仪器条件

2.3.1 高效液相色谱条件

高效液相色谱仪：Thermo Scientific Easy-nLC 1000

色谱柱：C18 ,3μm, 100Å ,75μm×15 cm

上样量：均18 ul

流动相：A：0.1% Formic acid in water； B：0.1% Formic acid

in Acetonitrile

色谱梯度：

2.3.2 质谱条件

标准品：

质谱仪：Thermo Scientific Q Exactive

喷雾电压：2.6 kV

毛细管温度：250 ℃

S-lens：50%

碰撞能量：27% HCD

分辨率设置：一级70,000@m/z 200，二级17,500@m/z 200

母离子扫描范围：m/z 200-1800；子离子扫描范围：startfrom m/z 100

Data-dependent MS/MS：Top 20

标准曲线与正式样本：

质谱仪：Thermo Scientific Q Exactive

喷雾电压：2.6 kV

毛细管温度：250 ℃

S-lens：50%

碰撞能量：27% HCD

分辨率设置：35,000@m/z 200

Isolation Window：4 M/Z

Inclusion List：M/Z 451.75