DNA三代测序技术原理、平台、特点介绍

2020.5.19

王辉

致力于为分析测试行业奉献终身

人类基因组计划、基因芯片、个性化分子诊断、生物云计算……这些在21世纪第一个十年里吸引无数眼球的热门词汇，都和一个产业颇有渊源——DNA测序。生物技术和信息技术在这片创意新天地里水乳交融，如果用一句诗来形容坐拥两大技术护航的DNA测序产业，那就是——天生丽质难自弃。

随着人类基因组计划的完成，人类对自身遗传信息的了解和掌握有了前所未有的进步。与此同时，分子水平的基因检测技术平台不断发展和完善，使得基因检测技术得到了迅猛发展，基因检测效率不断提高。从最初第一代以 Sanger 测序为代表的直接检测技术和以连锁分析为代表的间接测序技术，到 2005 年，以 Illumina 公司的 Solexa技术和 ABI 公司的 SOLiD 技术为标志的新一代测序 (next-generation sequencing，NGS) 的相继出现，测序效率明显提升，时间明显缩短，费用明显降低，基因检测手段有了革命性的变化。

DNA测序技术经历了不同的发展阶段，本文将重点介绍第一代、第二代、第三代测序的基本原理、代表性的测序平台以及不同发展阶段的测序技术的特点。

第一代测序技术

传统的双脱氧链终止法、化学降解法以及在它们的基础上发展来的各种DNA测序技术统称为第一代DNA测序技术。人类基因组计划(human genome project，HGP)主要基于第一代DNA测序技术。

双脱氧链终止法

双脱氧链终止法又称为Sanger法。该方法的原理是：核酸模板在DNA聚合酶、引物、4种单脱氧核苷三磷酸(dNTP，其中的一种用放射性P32标记)存在条件下复制时，在四管反应系统中分别按比例引入4种双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)，因为双脱氧核苷没有3’OH，所以只要双脱氧核苷掺入链的末端，该链就停止延长，若链端掺入单脱氧核苷，链就可以继续延长。如此每管反应体系中便合成以各自的双脱氧碱基为3’端的一系列长度不等的核酸片段。反应终止后，分4个泳道进行凝胶电泳，分离长短不一的核酸片段，长度相邻的片段相差一个碱基。经过放射自显影后，根据片段3’端的双脱氧核苷酸，便可依次阅读合成片段的碱基排列顺序。

第一代测序技术的主要特点是：

测序读长可达1000bp；
准确性高达99.999%；
测序成本高；
通量低。

第二代测序技术（NGS）

随着人类基因组计划的完成，人们进入了后基因组时代，即功能基因组时代，传统的测序方法已经不能满足深度测序和重复测序等大规模基因组测序的需求，这促使了新一代DNA测序技术的诞生。新一代测序技术也称为第二代测序技术，主要包括罗氏454公司的GS FLX测序平台、Illumina公司的Solexa Genome Analyzer测序平台和ABI公司的SOLID测序平台。

第二代测序技术核心思想是边合成边测序（Sequencing by Synthesis)，即通过捕捉新合成的末端的标记来确定DNA的序列。以Illumina的技术原理为例做一下说明：先在片段DNA两端脸上接头，目的是能够匹配到芯片上的接头，接着与芯片杂交，进行桥式扩增，接着簇的形成，是为了保证信号强度，再加入四种有阻滞剂和荧光标记的单核苷酸，如此循环，记录每个循环的荧光信息，最后得到序列信息。

第二代测序技术最显著的特征是高通量，一次能对几十万到几百万条DNA分子进行序列测序，使得对一个物种的转录组测序或基因组深度测序变得方便易行，同时成本也大大下降。

Illumina测序流程

第三代测序技术

近年来，测序技术取得了新的进展，发展到第三代测序。第三代测序技术的核心理念是以单分子为目标的边合成边测序。该技术不需要经过PCR扩增，实现了对每一条DNA分子的单独测序。代表性的测序平台有PacBio公司的SMRT和Oxford Nanopore Technologies纳米孔单分子测序技术。

其中PacBio SMRT技术其实也应用了边合成边测序的思想，并以SMRT芯片为测序载体。基本原理是： DNA聚合酶和模板结合，4色荧光标记 4 种碱基（即是dNTP），在碱基配对阶段，不同碱基的加入，会发出不同光，根据光的波长与峰值可判断进入的碱基类型。同时这个 DNA 聚合酶是实现超长读长的关键之一。SMRT技术的测序速度很快，每秒约10个dNTP。

三代测序设备在DNA 序列片段读长上优于二代设备，但在准确度上较二代设备差，未来随着技术的改善，三代测序设备将更为稳定和成熟。