高压氧对大鼠行为学及应激相关指标影响的研究

高架十字迷宫实验相关文献-高压氧对大鼠行为学及应激相关指标影响的研究

【摘要】 目的通过对大鼠行为学及应激相关指标的观察，探讨高压氧与应激的关系。方法20只Wistar大鼠按照数字表法随机分为高压氧组和空白对照组，高压氧组给予0．20 MPa高压氧处理，连续治疗3周；对照组单纯喂养，分别在第l、7、14、21天对其进行高架十字迷宫试验，观察大鼠开臂逗留时间，利用酶联免疫吸附测定法测定其血清中促肾上腺皮质激素释放激素、促肾上腺皮质激素、糖皮质激素、一氧化氮合酶、一氧化氮及肿瘤坏死因子．a(TNF．d)含量。结果高压氧处理可明显增加大鼠外周血液中糖皮质激素(glucocorticoids，GCS)的水平，差异具有统计学意义(P<0．05)，但对大鼠高架十字迷宫中的开臂逗留时间、一氧化氮系统及TNF．0【的表达无明显影响(P>0．05)。结论高压氧处理符合慢性应激的一般特征，但又不对机体造成明显的不良影响，提示高压氧的作用机制之一是作为一种良性应激来增加机体对应激的耐受能力。

【关键词】高压氧；高架十字迷宫；HPA轴；一氧化氮系统；肿瘤坏死因子一Ot；大鼠

高压氧治疗在临床应用十分广泛，涉及临床诸多学科，脑外伤后恢复期、突发性耳聋、脊髓损伤及糖尿病足等疾病的治疗，其治疗过程中压力及呼吸氧气浓度的变化对于机体来说属于一种应激事件，因此长时间连续的高压氧处理有可能成为慢性应激源，所以了解高压氧对机体的影响对临床治疗十分重要。为此笔者设计了本实验，通过对大鼠的行为学、下丘脑．垂体一肾上腺皮质(HPA)轴、血清中一氧化氮系统及促炎症因子等进行观察，以探索高压氧对机体应激的影响。

材料与方法

1．实验动物与处理：8周龄雄性Wistar大鼠20只，体质量200—250 g，购自军事医学科学院实验动物中心。熟悉环境7 d，按数字表法随机平均分成2组：单纯高压氧组及空白对照组。单纯高压氧组：每天上午9：00—10：00，0．20 MPa，100％氧浓度，升压时间10 min，稳压60 min，减压时间15 min，连续治疗21 d；空白对照组：单纯饲养21 d。实验动物自由进食饮水，每天12 h光照。

2．高架十字迷宫试验：高架十字迷宫(由上海欣软信息科技有限公司提供）：高35 cm，2个开臂(open arm，OA)及2个闭合臂宽10 cm长50 em，闭合臂壁高25 cm，内侧及底部涂黑，高架十字迷宫上方约1 m处设有照明用500 W灯及摄像头。实验过程：每次试验前转移动物至高架十字试验室，熟悉环境10 min，实验动物背向操作人员置于高架十字迷宫中心，面向开臂，记录大鼠5 min的活动…。下次试验前用清水消除实验动物气味。高压氧组及空白对照组动物在熟悉环境1周后，分别于第1天、第7天、第14天及第21天作高架十字迷宫试验。实验结果以开臂逗留时间及开臂穿越数作统计。

3．麻醉及取材：实验动物在完成高架十字迷宫试验后，单纯饲养1 d，于上午9：00—12：00期间给予20％乌拉坦0．7 ml／100 g腹腔注射麻醉，肌肉完全松弛及角膜反射存在为麻醉成功标志。开腹，暴露腹主动脉，10 ml注射器取血，促凝管摇匀，以1 000 r／min离心10 min，离心半径r=15 cm，取上清液，一20℃保存。

4．血清标本指标的测定：通过酶联免疫吸附测定法(enzyme．1inked immuno sorbent assay，ELISA)测定血清中促肾上腺皮质激素释放激素(corticotropin releasing hormone，CRH)、促肾上腺皮质激素(adrenocor ticotropic hormore，ATCH)、糖皮质激素(glueocorticoids，GCS)、一氧化氮合酶(nitricoxide synthase，NOS)、一氧化氮(nitric oxide，NO)及肿瘤坏死因子一o【(tumor necrosis factor，TNF-d)含量，试剂盒购自碧云天生物技术研究所，使用MULTISKAN EX酶标仪检测。

5．统计学处理：数据以SPSS 13．0软件进行统计分析。原始数据用均数±标准差(元±s)表示，利用重复测量观察组间及组内是否存在差异。排除性检验水准设为仅=0．05，纳人性检验水准设为d=0．1。P<0．05表明差异有统计学意义。

讨 论

慢性应激的致病过程是复杂的，有研究认为其致病过程主要由GCS抵抗旧J、HPA轴负反馈障介导，而外周循环中促炎症因子及外周GCS的增加作为其终末效应很有可能是慢性应激的最终致病途径，其中炎症因子的增加可以促使NOS及NO表达的下降Hj，并有可能诱发动脉粥样硬化的出现。

循环炎症因子增加最突出的表现就是病态行为，如探索欲下降、摄食及运动减少，困倦以及认知功能的下降。所以本实验首先通过观察大鼠焦虑行为的变化，初步评价高压氧导致大鼠当次应激的程度。高架十字迷宫首先由File等于1985进行描述，主要通过观察实验动物开放臂及闭合臂逗留时间评估实验动物对外界的探索欲望，从而对其焦虑程度进行评估，有学者发现其对焦虑程度的评价相对于旷场试验要直接与准确。本实验可以看出，高压氧组大鼠的焦虑程度与空白对照组差异无统计学意义，提示高压氧处理在3周内可能并不会增加实验动物的焦虑程度。除此之外，本实验还发现第2周后高压氧组大鼠的开臂逗留时间开始减少，其原因可能为应激时间的长短所导致的，如同样的慢性束缚应激，不同的束缚时间导致了旷场试验结果的差异，高压氧也是如此，高压氧处理时间不一，其行为学表现也可能不同。提示高压氧治疗在应激损伤方面可能存在一个累积的效应。从本实验的结果出发，笔者推测高压氧治疗的疗程应维持在2—3周内，但是上述推论仍需通过进一步延长实验时间及增加样本量来明确。

HPA轴负反馈障碍作为应激致病的核心，主要表现为应激过程中HPA轴持续兴奋，即循环CRH、ATCH及GCS的增加。在慢性应激人群如抑郁症患者¨¨及慢性应激的动物模型¨纠中均可观察到这一现象。本实验观察到接受连续高压氧处理的大鼠其HPA轴上游的CRH及ATCH并无差别，但是其GCS水平明显提高，提示高压氧处理虽然出现了糖皮质激素的上升，但与一般的慢性应激不同。而这种HPA轴上游激素变化与GCS变化的不对称，说明了此时下丘脑一垂体段HPA轴负反馈通路是正常的。本实验出现的这种现象考虑与应激强度有关。在f临床研究中可发现处于慢性应激状态中个体的ACTH及CRH mRNA表达下降，但血清GCS的水平却持续升高，如Cotella等¨引对母爱剥夺人群的研究。另外慢性束缚应激，这类轻微的应激源同样可以导致实验大鼠外周持续高水平的GCS但并不表现出CRH及ACTH的上升¨引。结合本实验结果，推测HPA轴负反馈功能的异常可能仅存在于强度高持续时间长的应激事件之中。而高压氧可能属于一种轻微的应激，并不会对HPA轴的反馈功能造成损害。另外高压氧虽然其HPA轴负反馈功能保持正常，但是GCS的水平还是表现出明显的上升，推测其原因可能出现在肾上腺皮质上。有实验证明慢性应激并不会导致肾上腺皮质对ACTH的敏感性增加，提示GCS的水平持续升高则可能与其他因素相关，如肾上腺皮质的增生及肥大，导致其对ACTH刺激所分泌的GCS的量的增多¨6|。实验结束时，对大鼠的解剖也发现了高压氧处理组肾上腺的体积明显大于空白对照组，但是本实验并没有继
续就此推论继续对肾上腺进行称质量及病理学观察，此为本实验一个不足之处。

一氧化氮系统特别是血管一氧化氮系统受损在机体主要表现为内皮介导的血管舒张障碍，使得血管在血压变化时的自我调节能力降低，间接促进了内皮损伤的出现。内皮损伤结合多种因素最终导致了动脉粥样硬化的形成¨7|。循环炎症因子的增加作为慢性应激致病的直接途径之一，表现为循环IL一1、IL-6、TNF—d等的增加，此类炎症因子的增加可使缓激肽介导的血管舒张发生障碍、血管一氧化氮合酶(eNOS)的mRNA表达及蛋白含量下降，最终使H：O：表达上升，介导氧化应激¨8|。所以慢性应激对一氧化氮系统的影响主要来自于促炎因子的作用。故本实验尝试利用对一氧化氮系统及促炎症因子TNF．Ot的观察，评价高压氧治疗中出现的应激损伤的程度。本实验观察到高压氧虽然是一种应激源。但是与空白组相比NOS及NO的含量差异无统计学意义。提示高压氧处理可能并不会对大鼠的内皮NO系统产生影响。另外高压氧组中作为慢性应激致病原因之一的TNF一仅较空白组的低，虽无统计学意义但存在明显趋势，提示高压氧或能降低循环促炎症因子的合成。其中作为与交感神经拮抗的副交感神经被认为与交感介导的能量分布及系统炎症反应相拮抗，而为保证获得性免疫的强度，在炎症过程中其活性常被抑制019]，同时高压氧治疗中一个特点就是副交感神经的兴奋性增加，所以本实验推测TNF—a的降低可能通过副交感神经的兴奋，利用其抗炎作用，促使循环促炎因子下降，但上述推论仍需进一步实验的证明。

综上所述，本实验从应激的角度出发，观察到连续高压氧处理具备了慢性应激的一般特征，如循环GCS的提高；但另一方面其又不像一般慢性应激那样能明显增加机体的焦虑程度，同时还或许能够通过提高副交感的活性抑制炎症因子的产生、降低TNF．0【甚至其他促炎症因子的表达来使机体抵抗其他应激源造成的损害。

适当的应激能够加强机体对外界应激的抵抗能力，Ostrander等㈣1发现处于慢性应激恢复期的大鼠在接受新类型的刺激后表现出GCS、ACTH水平及室旁核CRH mRNA的下降。说明了大鼠对应激是有适应性的，故能否达到有效的适应能力，而且在此之间并未对机体发生损伤可能就是良性应激的界定标准。而本实验所初步观察到的结果提示，连续的高压氧治疗对机体来说具备了作为良性应激的前提，即可能对机体没有造成过多的损伤甚至能降低其他应激源的损害，但是否能作为良性应激被利用还需要进一步实验的验证。