研究背景：麻醉后处死动物在应激方面的研究是普遍的，但是麻醉对结果的影响研究不足。我们的目的是探究不同麻醉剂的影响，如在大鼠急性应激反应时腹腔注射戊巴比妥钠或吸入异氟烷。
方法：将大鼠随机分为电击（FS）和非应激对照组，进一步设定处死程序：直接斩首，腹腔注射戊巴比妥钠或吸入异氟烷后斩首。再设定一组对照组腹腔注射生理盐水后断头处死。测定血浆皮质酮（CORT），睾酮和雌二醇，下丘脑应激相关分子表达的促肾上腺皮质激素释放激素，血管加压素和催产素，与额叶相关分子表达的NMDA受体NR2B亚单位，GABAA受体和神经元烟碱型乙酰胆碱受体。
结果：直接斩首组和异氟烷电击（FS）显著增加血浆皮质酮（CORT），而腹腔注射戊巴比妥钠注射后，这种应激反未出现。非应激对照组动物，无论是注射生理盐水还是戊巴比妥钠都引起的血浆皮质酮（CORT）显著增加。各组间性激素水平和大脑中的相关分子mRNA的表达差异显著。
结论：混合注射麻醉导致动物应激反应，妨碍了血浆皮质酮（CORT）水平，但影响血浆性激素水平和大脑mRNA的表达。异氟烷吸入应激反应影响较少，而且从实验动物伦理的角度来看，也是最理想的。
1.简介
应激反应与情感性精神障碍病因学的关系[ 1 ]促进了动物模型应激反应的研究。压力调节系统如下丘脑-垂体-肾上
腺（HPA）轴活动已在不同的应激活动下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）活性研究是由促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）驱动的物质主要来自下丘脑室旁核（PVN）的下丘脑。HPA轴的最终目标的压力荷尔蒙激素，这主要是在大鼠皮质酮（CORT）。我们和其他组发现性激素如睾酮（T）、雌二醇（E2）和神经肽，如精氨酸加压素（AVP）和催产素（OXT），在压力反应[
2 ]起重要调节作用。
处死动物的方式来研究可能的混淆作用引起了我们的关注。相关的生物学研究处死动物一般有两种方法：直接断头或给药后麻醉断头。断头可能是一个潜在的额外的压力，这也取决于研究者的经验，会影响研究结果[
3 ]。无意识的麻醉药似乎减少了额外的压力[ 4
]。然而，一些药物，如苯巴比妥，也会引起额外的应激反应，表现为增加血浆CORT水平[5,6]。此外，麻醉剂影响兴奋性受体抑制大脑的活动，包括N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体NR2B亚单位与神经元烟碱型乙酰胆碱受体（nnachr），通过抑制受体刺激如GABAA受体（GABAAR）[
7
]。到目前为止是否经常使用麻醉剂如腹腔注射（ip）戊巴比妥钠或异氟烷吸入可能影响大鼠脑mRNA表达与在急性应激反应有关的分子，也不清楚腹腔注射戊巴比妥钠如何引起动物的附加应激。
因此我们分析了经验丰富的研究员用不同方式处死动物的影响，大鼠腹腔注射戊巴比妥钠和吸入异氟烷后电击（FS）和不刺激对照组比较，比较内容包括血浆CORT，T和E2水平，下丘脑CRH
mRNA水平，AVP和OXT，与额叶NMDA-NR2B、 GABAAR、 mRNA和nnAChR的表达水平。
2.实验方法
2.1 伦理陈述
所有动物使用和实验均按照实验动物的使用和保护指南(National Research Council, 1996, USA)，经中国国家委员会浙江分会批准。尽最大努力来减少动物的痛苦，并尽可能少用动物（更多细节见补充材料1）。
2.2 电击大鼠
雄性SD大鼠（体重300-330g），饲养在25-27℃房间，12h明暗交替，自由摄食饮水。给予一周时间适应环境。拟定0.5mA电刺激5s，然后间隔25min。动物居住条件和卫生细节连同FS协议见辅助材料1.将大鼠随机分为7组：1）对照或2）FS通过直接断头处死大鼠（分别为黄连解毒汤，FSD）；3）控制或4）腹腔注射3.5%戊巴比妥钠（3ml/kg）5分钟后FS大鼠断头处死（分别为和FSP）；5）对照或6）4%异氟醚在吸氧后1–2分钟FS大鼠断头处死（综合技术研究所或FSI组）；7）额外的对照组腹腔注射生理盐水（3毫升/公斤）5分钟后断头处死（CTR）。每组7只或8只大鼠。由相同的研究人员，电击（FS）30分钟内处死动物，实验在每日15:00-16:00之间。采血、离心、收集血浆。迅速取出大鼠大脑、下丘脑和额叶进行解剖。根据Paxinos和Watson的图集[
10 ]下丘脑解剖位置是前囟点1.7mm。
所有的样品都是立即冻结并存储在−80°C直到进行检测。所有程序均符合当地动物保护委员会的有关规定和法律。
2.3 血浆激素水平测定
采用酶联免疫法测定血浆CORT水平(RE52211,
IBL Corporation,
Germany)。变异(CV)的内和间变异系数分别为3.38%和10.50%。用放射免疫分析法检测血浆T水平(IM1087,
Immunotech Corporation,
USA)，一个内和批间CV分别为2.6%和11.9%。通过酶联免疫试剂盒测定血浆E2水平(ADI-900-174,
Enzolifesciences Corporation, USA)，一个内和跨3.9%和11.37%的CV，分别。
2.4 定量逆转录聚合酶链反应（PCR）在下丘脑和额叶的mRNA表达分析
对下丘脑CRH，AVP
mRNA与额叶NR2B，GABAAR和nnachr表达水平的检测方法是光电导继电器Q-PCR。总之，全部
RNA用Trizol提取剂和基因与PrimeScript RT试剂盒合成。Q-PCR采用Bio-Rad cfx96触摸荧光PCR仪进行比[ 11
]。所有的程序都是按照制造商的指示进行的。引物对CRH，AVP，OXT，NR2B，GABAAR-受体，nnachr和β肌动蛋白mRNA设计与程序Primer
Premier 5。作为管家基因（见辅助材料2）
2.5 统计
当数据被发现是不是正态分布，采用非参数测试。多组比较，第一–沃利斯试验采用Kruskal，如果有显著性差异，组间比较进一步进行–Mann Whitney U检验。P＜0.05被认为是重要的。
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