Mirrorball高通量抗体筛选平台的应用：一步法检测，抗体药筛选研发的新模式
以抗体技术为基础的免疫检测应用和相关的疾病治疗领域如癌症，自身免疫系统疾病等一直推动着抗体筛选的研究。单克隆抗体由特定的细胞系分泌到上清液中，而对上清液中特异性抗体的筛选则成为了药物初期研发的核心领域。
均相结合实验
尽管ELISA和流式细胞仪等传统手段被广泛应用，但是这两种检测手段都存在各自的局限性，特别是对细胞表面低表达抗原的检测。同时，这两种平台需要很繁琐的洗板和孵育的步骤而且耗费大量细胞和时间才能获取数据。为了解决这些技术瓶颈，我们开发了Mirrorball这个高灵敏度检测平台和“混合及读数之一步法检测”的实验方案，这样就大幅度地提高了抗体筛选的通量并且避免了繁琐的实验步骤。您所需要进行的实验仅仅是将所有的反应物一次性地加入到孔中并孵育一段时间。这里待检测的可以是结合在微球上的可溶性抗原也可以是细胞表面表达的抗原，一旦反应达到平衡状态，那么结合了待测抗体的微珠或细胞可以很快地通过荧光标记的二抗来检测到。相比于流式和传统ELISA，Mirrorball通过一种均相免洗的方式，让您利用最少的试剂耗材、最低的时间、人力成本以及更高的通量和自动化整合来进行抗体药物的初筛。希望给您带来最为简便和高效的抗体药筛选体验，别适用于研究昂贵和低丰度的抗原。
Mirrorball高通量抗体筛选平台
均相抗体结合实验的分析
Mirrorball和另一款类似产品ABI 8200 FMAT 都在设计上融入了很多适用于均相结合实验的特性。通过使用激光作为激发光源和光电倍增管作为检测装置，这使得它们能够检测到低亲和力的抗体和低丰度的抗原的结合。两个系统都在光路设计上最大程度的降低了背景荧光并在扫描读数的时候大幅度的提高了信噪比。在这个应用介绍里我们特别的比较了两个平台 Mirrorball和ABI 8200 在通过细胞水平实验进行抗体筛选时的性能优异性。通过对比，我们展示了Mirrorball的多重荧光检测能力，这使多重抗原标记并同时检测成为了可能。
方法
细胞系和培养方法
在这项研究中，比较了Mirrorball和ABI8200系统在进行A431细胞EGFR抗体结合实验时的。 A431细胞在EMEM培养（EBSS）（Sigma公司）含10％胎牛血清，2mM谷氨酰胺（Sigma公司），1X非必需氨基酸（NEAA）（Sigma）和100 U / mL青霉素以及100 U / ml链霉素。 A431细胞培养至80％汇合度时用0.25％胰蛋白酶和EDTA收集，洗净悬浮在培养基中。除非另有说明，培养试剂均购自Life Technology。
抗体和试剂
检测抗体，鼠抗人表皮生长因子抗体（抗EGFR抗体），购自Merck Chmicals Ltd（＃GR01）。山羊抗鼠IgG，AlexaFluor647 （＃A21235）由Life Technologies公司提供。
CFSE标记
5（6） - 羧基二乙酸N -琥珀酰亚胺酯（CFSE）（Sigma公司）配置为100mM在DMSO溶液里。 CFSE（10nM）被添加到细胞里并在室温中孵育10分钟。用4％FBS的PBS（2ml）终止反应。进一步孵化，于37° C下10分钟后，细胞1000 x g离心5分钟。
EGFR实验
抗EGFR抗体在培养基中梯度稀释，并添加20ul到384孔板中（Costar＃3712）。对于Mirrorball系统，暂停用CFSE标记A431细胞含有1 ×105个细胞/ mL和6nM抗鼠IgG AlexaFluor647二抗。对于ABI的8200平台，准备A431细胞的悬浮液包含4× 105细胞/ mL和6nM抗鼠IgG AlexaFluor647。首先，加入在各孔中加入20uL混合有荧光二抗的细胞悬液在37℃，孵育2小时。分别在Mirrorball和ABI8200平台上进行扫描并测定结合有EGFR抗体的细胞数量。最后，Mirrorball和ABI8200的浓度分别为2000细胞/孔和8000细胞/孔，3 nM抗体结合（图1）。
图1. Mirrorball表皮生长因子受体检测示意图。ABI 8200的实验protocol基本一致，除了加入的A431浓度为4 X 105细胞/ ml。
Mirrorball的数据扫描和获取
微孔板进行扫描，使用488和640纳米的指定激光器。每孔中的细胞都会“on”使用TTP LabTech公司ZL的阈值算法和两种形态荧光参数前面所述报告鲍文和卫理（1）。全井扫描和数据可视化中的各种方式，包括直方图或散点图，3D荧光强度分布，或整个以及使用Mirrorball的图像Cellista™软件。
ABI 8200的数据扫描和获取
使用640 nm激光扫描样品。进行细胞计数和荧光总强度导出到Excel文件和处理如 Lee et al（2）。实验数据仅仅收集了孔中心1 mm2的面积大小的区域。
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