材料

RBL-2H3：含有内向整流钾通道(Kir)的大鼠嗜碱性白血病细胞 (ATCC Cat. #CRL-2256)

培养基：Eagle’s Minimum Essential Media (ATCC Cat. #30-2003), 10% FBS (Hyclone Catalog Cat. #SH-30071)

不含钙、镁的PBS (Invitrogen Cat. #14190-144) Trypsin/EDTA (0.05% Trypsin/1mM EDTA) (Invitrogen Cat. #25300-054)

VSP溶液-1：160 mM NaCl (Sigma Cat. #S-5886), 4.5 mM KCl, (Sigma Cat. #P5405), 2 mM CaCl2 (Sigma Cat. #C-7902), 1 mM MgCl2 (Sigma Cat. #M-4880), 10 mM glucose (Sigma Cat. #G-7021), 10 mM HEPES (Invitrogen Cat. #15630-080), pH 7.4

高钾溶液：164 mM KCl, 2 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 10 mM glucose, 10 mM HEPES, pH 7.4

无菌水 (Irvine Scientific Cat. #9309)

DMSO (Dimethyl Sulfoxide, Aldrich Cat. #47,230-1)

氯化钡 (Sigma Cat. #B-0750)

Pluronic F127 (Invitrogen Cat. #P3000)

电压敏感探针试剂盒：DisBac2(3)和CC2-DMPE (Invitrogen Cat. #K1016), VABSC-1 背景抑制染料 (Invitrogen Cat. #K1019)

FLIPR^TETRA 高通量荧光检测分析系统(Molecular Devices)

方法

细胞准备

用胰酶消化预先培养的RBL-2H3细胞，实验前18-24小时清洗并种植在BD BioCoat™多聚赖氨酸包被的384孔板 (Cat. #356663, BD Biosciences)中，每孔12,500个细胞。细胞在37°C和5% CO2条件下过夜培养。实验开始当天母液、染料和缓冲液可室温放置。VSP加载缓冲液和氯化钡浓度梯度化合物在VSP-1缓冲液中配制。

准备VSP加载缓冲液

CC2-DMPE缓冲液：

Step 1 准备5mM DMSO母液并分装保存至-20°C。

Step 2 实验开始当天，准备一份工作溶液。CC2-DMPE母液和同体积的10% Pluronic Acid混合并随后用VSP-1溶液稀释至5μM。

Step 3 缓冲液在使用前充分混合并避光。

DiSBAC2(3)缓冲液：

Step 1 准备12mM DiSBAC2(3)的DMSO母液并保存至 -20°C.

Step 2 准备200mM VABSC-1的水质母液并在室温下避光保存。更多说明参考Invitrogen VSP 产品手册

Step 3 实验开始当天，用VSP-1溶液准备4μM DiSBAC2(3)的工作溶液，其中含有0.2μM VABSC-1 淬灭剂。在FLIPRTETRA系统中进行VSP染料实验除安装相应的LED和滤光片之外没有其它特别要求。

细胞中加载染料

Step 1 去除384孔板中所有孔的培养基，并加入50μL VSP-1溶液代替。

Step 2 立即去除VSP-1溶液并加入25μL的CC2-DMPE加载缓冲液。

Step 3 室温下细胞板覆盖避光孵育30分钟。

Step 4 30分钟后去除CC2-DMPE加载缓冲液并加入50μL的VSP-1溶液。

Step 5 立即去除VSP-1并加入25μL的4μM DiSBAC2(3)和0.21 μM VABSC-1加载缓冲液。

Step 6 加入10X 浓度的BaCl2 化合物(离子通道抑制剂)至相应的孔中

Step 7 室温下细胞板避光孵育30分钟。更多详细信息参考Invitrogen VSP使用指南。

FLIPR^TETRA 系统配置和校正

FLIPRTETRA 系统的操作软件ScreenWorks.具有非常友好的用户界面，便于进行实验方案的编辑和参数设置。更多信息可参考FLIPRTETRA 用户指南。系统自带一个黄色检测板可用于校正390–420nm激发光源LED和565–625nm发射光滤片。 含有7-二乙胺香豆素-3-羧酸的检测板被用于校正390–420nm激发光源LED和440–480nm发射光滤片，具体步骤见下。

390–420 nm激发光源LED和440–480 nm 滤光片 校正板制备

Step 1 配制0.02M的7-二乙胺香豆素-3-羧酸DMSO母液（Molecular Probes Cat. #D-1421）。

置于离心管中涡旋混合。

Step 2 分装成小份并保存于-20°C。

Step 3 在校正的1小时内，溶解一份第二步母液并在同样的用于染料加载的缓冲液中稀释成20–30 mL 10-5 M溶液。调节pH值至7.4，涡旋混合。

Step 4 每孔加入分装的香豆素溶液25μL（384孔板）或100μL（96孔板）。

在FLIPRTETRA系统中运行VSP实验

实验溶液体积、加样高度和速度等参数取决具体具体实验和细胞类型的要求来进行优化，以避免吹动孔底的细胞。

表1是推荐的RBL-2H3细胞实验机器参数设置，以供参考。

在FLIPR^TETRA系统中，加入25μL高K+去极化溶液前440–480nm和565–625nm的信号依次被记录10秒并在加样后40秒再次被记录10秒。实验中这两个时间点平均的信号记录构成了比率分析的基础。