PI、7-AAD和DAPI的染色原理及使用方法区别

英文全称

Propidium iodide 碘化丙啶

7-amino-actinomycin D 7氨基放线菌素

4’,6-diamidino-2-phenylindole 4，6-联脒-2-苯基吲哚

染色原理

荧光染料PI（碘化丙啶）是一种可对DNA染色的细胞核染色试剂，常用于细胞凋亡检测，英文全称是Propidium Iodide。它是一种溴化乙啶的类似物，在嵌入双链DNA后释放红色荧光。

7-AAD 是一种核酸染料，它不能通过正常质膜，随着细胞凋亡、细胞死亡过程，质膜对7-AAD的通透性逐渐增加，结合细胞凋亡中DNA的有控降解，在合适波长激发光的激发下可发出明亮的红色荧光，通过7-AAD标记DNA的强弱，将细胞分为三群：7-AAD强为死亡细胞，7-AAD弱是凋亡细胞，7-AAD-为正常活力细胞。

DAPI可以穿透细胞膜与细胞核中的双链DNA结合而发挥标记的作用，可以产生比DAPI自身强20多倍的荧光，和EB相比，对双链DNA的染色灵敏度要高很多倍。

膜通透性

否

否

能

染色位置

细胞核

细胞核

细胞核

灵敏度

中

中

高

检测通道

使用488 nm激发，用610/20 BP收集， FL-2检测通道

用488nm激发，用670/14BP收集，FL-3检测通道

用355nm激发，用440/40BP收集；也可用405nm激发，450/50BP收集

能否检测早期细胞凋亡

能

能

不能

缺点

不能区别晚期凋亡和坏死细胞

不能区别晚期凋亡和坏死细胞

强烈致癌

使用方法

（1)、用合适的方法诱导细胞凋亡；

(2)、悬浮细胞离心（1500rpm 离心 5min）收集；贴壁细胞用不含EDTA的胰酶消化并用含血清培养基洗一次（注：胰酶消化时间不易过长，否则容易引起假阳性）；或直接用Accutase酶消化（无需终止）；1500rpm 离心 5min收集细胞；

(3)、用PBS洗涤细胞两次（1500rpm离心5min）收集1-5 X105细胞，弃上清；

(4)、制备1X Binding Buffer缓冲液：按10次分析的量计算，加1ml  5X Binding Buffer缓冲液到4ml的去离子水；

(5)、用500ul  1X Binding Buffer重悬细胞(第4步稀释的缓冲液）

(6)、加入5ul annexin-V FITC和10ul PI

(7)、避光室温孵育5分钟

(8)、上机检测

1.通过合适的方法来诱导细胞凋亡；

2.清洗两次细胞；在第二次清洗后，去除细胞颗粒残留的PBS。

3.在冷的1X结合缓冲液重悬细胞，使细胞浓度达到1 x 106 到1 x 107 cells/mL。 

4.添加100ul细胞（106个）悬液到每管。

5.添加5 μl ofAnnexin V-PE 和 10μl的 7-AAD. 

6.温柔混匀，冰上孵育15分钟。

7.不用清洗，添加1X结合缓冲液到每管。

8.流式数据分析。

1.稀释DAPI储存液到3 微摩染液（100mM Tris,PH7.4,150Mm,NaCl,
1mMCaCl2,0.5mM MgCl2,0.1%Nonidet P-40），每个细胞样品中需要1 ML。

2.在室温下，轻轻弹管使得细胞颗粒分散，添加5mL的PBS，让细胞水化15分钟。
3.离心上述的悬浮细胞，弃悬浮液。轻轻弹管使细胞分散，添加1ML的被染液稀释的DAPI容液。

4.流式分析染料的存在。如果细胞在绿色荧光显微镜下能够看到，离心样本，去除上清，在新鲜的缓冲溶液中重悬。

5.提供一滴到显微载玻片上，用盖玻片盖住，观察。