分析测试百科网

搜索

喜欢作者

微信支付微信支付
×

RNA实验和方案新手必读(四)

2020.6.08
头像

王辉

致力于为分析测试行业奉献终身

溶液(水或者其它溶液)应该使用0.1%的DEPC处理。DEPC是一种强大但非绝对的RNase抑制剂。浓度为0.1%的DEPC经常用于处理玻璃或者塑料耗材,以使其表面的RNase失活,或者制备不含RNase的的溶液和水。DEPC通过共价修饰使RNase失活。在100 ml要处理的溶液中加入0.1 ml DEPC,大力的摇晃,以使DEPC充分进入溶液。将溶液在37°C的条件下孵育12个小时。在高压灭菌器内处理15 min以去除任何DEPC的痕迹。DEPC与伯胺发生反应,因此不能直接用于处理Tris缓冲液。在Tris缓冲液存在的条件下,DEPC非常不稳定,迅速分解为乙醇和CO2。在制备Tris缓冲液时,应先使用DEPC处理水,然后将Tris溶解以制备合适的缓冲液。痕量的DEPC会通过乙酰基化作用,与RNA分子中的嘌呤残基反应,将其修饰。在细胞外的环境中,乙酰基化的RNA分子以很低的效率被翻译。但是,除非有大量的嘌呤残基被修饰了,否则不会严重的影响这些RNA分子杂交形成DNA:RNA或者RNA:RNA杂交物的能力。溶液或者器皿上残留的DEPC,一定要在高压灭菌器中处理或者加热到100°C处理15 min,以便除去。

重要:在使用化学试剂时,一定要穿戴合适的实验工作服,一次性的手套以及护目镜。请参考产品厂商提供的相应安全数据说明书(SDS),了解更多信息。


生物样本中RNA的稳定处理

为了确保基因表达分析的精确性,所分析的RNA应能够准确地反映出其在生物样本中的体内表达情况。但实际在样本的操作和RNA的分离过程中,RNA很容易发生改变而使情况变得复杂。

生物样本一经提取,其中的RNA即变得极不稳定。期间所发生的人为影响主要分成两种。基因的下调和RNA的酶促降解会导致mRNA特异性或非特异地发生人为降低。同时在操作和加工样本的过程中,某些基因会被诱导表达。这两种效应的综合可能在检出的转录谱与体内真实情况之间造成偏差。

对RNA表达谱进行即刻的稳定化处理是精确基因表达分析中的首要事项。通常情况下,用于RNA分析的样本被迅速置于液氮中冷冻,在进一步处理之前一直储存于–80°C下。产品供应商也提供了一些稳定处理试剂,作为替代方法对生物样本中的RNA进行稳定化处理。这些供应商提供了集成化的样本处理溶液(套装),其中包括容器,稳定处理试剂及制备试剂盒

RNA的大小和分子量

不同RNA的大小和分子量RNA核苷酸分子量(道尔顿)E. coli tRNA 5S rRNA 16S rRNA 23S rRNA75 120 1541 29042.6 x 104 4.1 x 104 5.2 x 105 9.9 x 105果蝇 18S rRNA 28S rRNA1976 38986.7 x 105 1.3 x 106小鼠 18S rRNA 28S rRNA1869 47126.4 x 105 1.6 x 106兔子 18S rRNA 28S rRNA2366 63338.0 x 105 2.2 x 106人 18S rRNA 28S rRNA1868 50256.4 x 1051.7 x 106

来自参考文献2。换算为核酸:RNA

RNA分子量和摩尔换算

单链RNA分子的MW(钠盐)= (碱基数量) x (343道尔顿/碱基)

RNA摩尔换算*RNA微克量皮摩尔分子1.01.671.0 x 10120.61.01.0 x 1011

* mRNA平均长度为1930个核苷酸。


互联网
仪器推荐
文章推荐