RNA实验和方案新手必读（五）

起始材料的有效破碎和匀浆对于所有总RNA分离操作来说都是必须的要求。破碎和匀浆是两个独立分开的步骤。

• 破碎：对于组织结构、细胞壁和细胞质膜的彻底破碎对于释放样本中所有的RNA是绝对必要的。不同样本需要使用不同的方法以达到彻底的破碎效果。不完全的破碎会导致RNA得率的显著降低。

• 匀浆：匀浆对于减少破碎后细胞裂解产物的粘性是十分必要的。匀浆能够切断高分子量的基因组DNA及其他高分子量的细胞组分，得到均匀的裂解产物。匀浆不够彻底会导致RNA结合效率的下降而显著降低得率。

某些破碎方法能够同时对样本起到匀浆作用，而其他方法还是需要专门的匀浆步骤。表针对不同样本进行破碎和匀浆的准则全面概述了适用于多种起始材料的不同破碎和匀浆方法。当您针对所使用的起始材料选择合适的操作方法时，该表格可用来作为参考。下面也将针对破碎和匀浆方法进行更为详细的论述。

使用玻珠研磨机进行破碎和匀浆

在使用玻珠研磨机破碎样本的过程中，样本与珠子被一起进行高速搅拌。通过珠子与细胞碰撞时的流体动力切割和破碎作用，同步完成破碎和匀浆过程。破碎效率的影响因素有：

• 珠子的大小和组成

• 缓冲液与珠子的比例

• 起始样本的数量

• 搅拌速度和设定

• 处理时间

细菌破碎时所使用的理想珠型为0.1毫米（平均直径）的玻璃珠，用于酵母和单细胞动物细胞时为0.5毫米的玻璃珠，对动植物组织则应使用3–7毫米的不锈钢珠。请确保玻璃珠经过浓硝酸的预先润洗。或者可直接购买和使用市售的经酸洗涤过的玻璃珠。关于破碎的其他参数需要依据每一应用的经验进行设定。植物材料以及相关的珠子和破碎管可先在液氮中预冷，破碎应在无裂解缓冲液的条件下进行。对于动物组织则应使用干燥的冷冻粉碎。冷冻粉碎（无论是在玻珠研磨机中还是使用研钵和杵）不同于缓冲液裂解，不会对样本同时起到匀浆作用。

使用转子——定子匀浆器进行破碎和匀浆

在裂解缓冲液的存在下，转子–定子匀浆机可同时完成对动物组织的彻底破碎和匀浆，所需时间基于样本的坚韧程度，可在5–90秒内完成。转子–定子匀浆机也可以用于细胞裂解产物的匀浆。转子的超高速旋转能够以扰动和机械剪切的综合方式，完成对样本的破碎和匀浆。使用适当大小的管子，在匀浆过程中始终保证匀浆器头部一直处于浸没状态，并持续将匀浆器头部伸入管子末端，以确保匀浆过程中样本内的泡沫达到最少。转子–定子匀浆机有不同大小型号可供选择，并可装配不同大小的探头。5 mm和7 mm的探头适合在300 µl以下的体积内使用，并可用于离心管内的匀浆。10 mm及以上尺寸的探头则适用于更大的管子。

使用研钵和杵破碎

使用研钵和杵破碎时，先将样本进行迅速的液氮冷冻，并在液氮中将其研磨为细粉。将上清液（组织粉末和液氮）转移至液氮预冷的适当大小的管中，使液氮挥发但不要让样品融解。加入裂解缓冲液，并尽可能快地进行后续步骤。

注：使用研钵和杵研磨样品会破碎样品，但无法达到匀浆的目的。匀浆作用需与此步骤分开进行。

使用注射器和针头完成匀浆

细胞和组织的裂解产物可以使用注射器和针头进行匀浆。可以使用20号（0.9 mm）针头连接一个灭菌塑料注射器，通过至少5–10次的吹打切断高分子量的DNA，直至裂解产物的匀浆形成。为操作便利和减少样品损失，也可能需要增加裂解缓冲液的体积。