【细胞制备】
1．外周血单个核细胞的采集
1.1 用血细胞分离机采集患者自身的外周血单个核细胞50-100mL；
1.2 淋巴细胞分离液密度梯度离心法进一步纯化单个核细胞(PBMC)；
1.3 无血清培养液洗涤2次，获得纯度在90%以上的PBMC。
2．CIK细胞的培养及鉴定
2.1 将PBMC按1-2x 106/ml的浓度悬浮于无血清培养液中，加入1,000 U/ml的重组人IFN-γ，37oC，5%CO2培养箱中培养；
2.2 24h后加入50ng/ml的CD3单克隆抗体和300 U/ml的重组人IL-2，刺激CIK细胞的生长和增殖；
注：此时也可同时加入100 U/ml的重组人IL-1α。
2.3每3天半量换液或扩瓶一次，并补加重组人IL-2 300 U/ml；
2.4在培养的第14d，收获CIK细胞。
2.5 CIK细胞质控：
2.5.1 台盼蓝染色检测：活细胞应在80%以上；
2.5.2 流式细胞仪检测细胞表面CD3、CD8、CD56等分子的表达：CD3+CD56+细胞的比例应在20%以上。
2.5.3
细胞杀伤实验：以CIK细胞为效应细胞，以肿瘤细胞(可为原代肿瘤细胞或肿瘤细胞株)为靶细胞，将效应细胞与靶细胞按10:1(数目比)的比例加入96孔U型板中，每孔含靶细胞1
x 104个，终体积为200μl，设3个复孔。培养4h，然后取培养上清，用乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒检测效应细胞对靶细胞的杀伤率。
2.5.4收获细胞前，取少量培养物进行细菌、真菌培养，并检测支原体、衣原体，及内毒素(标准：病原学检测阴性，内毒素<5 Eu)。
【步骤简图】
生产商 产品名称 产品编号 产品规格 使用浓度
eBioscience Anti-Human CD3 Functional Grade Purified 16-0037-85 500μg
PeproTech- biogems Anti-Human CD3 SAFIRE Purified 05121-25 100μg/500μg
PeproTech 重组人IFN-γ (Animal Free) AF-300-02 100μg/250μg/500μg/1mg 50ng/ml
PeproTech 重组人IL-1α (Animal Free) AF-200-01A 10μg/100μg/250μg/500μg/1mg 0.1ng/ml
PeproTech 重组人IL-2 (Animal Free) AF-200-02 50μg/100μg/250μg/500μg/1mg 30ng/ml
【推荐试剂】
生产商 产品名称 产品编号 产品规格
PeproTech 重组人Flt-3 Ligand (Animal Free) AF-300-19 10μg/50μg/100μg/250μg/500μg/1mg
PeproTech 重组人IL-7 (Animal Free) AF-200-07 10μg/100μg/250μg/500μg/1mg
PeproTech 重组人IL-15 (Animal Free) AF-200-15 10μg/100μg/250μg/500μg/1mg
PeproTech 重组人SCF (Animal Free) AF-300-07 10μg/50μg/100μg/250μg/500μg/1mg
注：Animal
Free意为无动物成分。无动物成分的重组细胞因子在生产过程中不会有任何动物源性物质，尤其是牛蛋白的混入，使得最终获得的重组人蛋白中不含任何动物成分。这样可避免动物病原体(如疯牛病，克雅氏病等)的污染及外源蛋白引起的机体异种排斥和过敏反应，因此细胞治疗的体外细胞培养过程中最好使用无动物成分的重组细胞因子。
【参考文献】
[1] Li R, Wang C, et al. Autologous cytokine-induced
killer cell immunotherapy in lung cancer: a phase II clinical study.
Cancer Immunol Immunother. 2012; 61:2125–2133
【背景知识】
DC是“Dendritic
Cells”的缩写，中文全称为“树突状细胞”，因其成熟时伸出许多树突样或伪足样突起而得名。DC是由2011年诺贝尔奖获得者、加拿大籍科学家Ralph
M. Steinman于1973年发现的，是目前发现的功能最强的抗原递呈细胞(Antigen Presenting Cells,
APC)。已证实，DC是唯一能够显著刺激初始T细胞(Naïve T
cells)增殖的APC，成熟的DC可以通过Ⅱ型组织相容性抗原（MHC-Ⅱ）等途径提呈肿瘤抗原，有效抵制肿瘤细胞的免疫逃逸机制，而其它APC(如单核巨噬细胞，B细胞等)仅能刺激已活化的或记忆性的T细胞。DC是机体适应性T细胞免疫应答的始动者，在肿瘤免疫中具有极其重要的作用。
CIK是单个核细胞在CD3单抗和多种细胞因子(包括IFN-γ，IL-2等)的作用下培养获得的一群以CD3+CD56+细胞为主要效应细胞的异质细胞群，其既具有T淋巴细胞强大的抗肿瘤活性，又具有NK细胞(自然杀伤细胞)的非MHC(主要组织相容性抗原)限制性肿瘤杀伤能力。
DC-CIK
(或DC+CIK)[1]是指与DC细胞共培养的CIK细胞，也可以说，最终的效应细胞是经DC体外活化的CIK细胞。多项研究表明，DC与CIK具有协同作用，共同孵育后，DC表面共刺激分子的表达及抗原递呈能力均明显提高，而CIK的增殖能力和体内外细胞毒活性也得以增强，因此DC-CIK较单独的CIK治疗更为有效。若将肿瘤抗原负载的DC与CIK共培养，可刺激产生肿瘤抗原特异性的T细胞，这样的DC-CIK治疗则兼具特异性和非特异性双重肿瘤杀伤作用，比未负载肿瘤抗原的DC刺激活化的CIK活性更强，常被用于临床和科研。
CIK细胞和DC细胞是细胞免疫治疗的2个重要组成部分，两者联合可确保高效的免疫反应。
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