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细胞培养常见问题解答(四)

2020.6.08
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王辉

致力于为分析测试行业奉献终身

另:这里补充一下培养用品的消毒,供参考:

细胞培养的最大危险是发生培养物的细菌,真菌和病毒等微生物的污染,污染主要是由于操作者的疏忽而引起,常见的原因有操作间或周围空间的不洁,培养器皿和培养液消毒不合格或不彻底,由于有关培养的每个环节的失误均能导致培养失败,故细胞培养的每个环节都应严格遵守操作常规,防止发生污染。

消毒方法分为三类:

(A) 物理灭菌法(紫外线、湿热、过渣等);

(B) 化学灭菌法(各种化学消毒剂);

(C) 抗生素。

(1)紫外线消毒:用于空气,操作台表面和不能使用其它法进行消毒和培养器皿。紫外线直接照射方便、效果好,经一定的时间照射后,可以消灭空气中大部分细菌,培养室紫外线灯应距地面不超过2.5米,且消毒进物品不宜相互遮档,照射不到的地方起不到消毒作用。

紫外线可产生臭氧,污染空气,试剂及培养液都有不良影响,对人皮肤也有伤害,不宜近照射也进行实验操作。

(2)温热消毒:即高压蒸气消毒,是一种使用最广泛、效果最好的消毒方法。温热消毒时,消毒物品不能装得过满,以防止消毒器内气体阻塞而千百万危险,保证其内气体的流通。在加热升压之前,先要打开排气阀门排放消毒器内的冷空气,冷气空气排出后,关闭排气阀门,同时检验安全阀活动自如,继后开始升压,当达到所需压力时,开始记算消毒时间。消毒过程中,操作者不能离开工作岗位,要定时检查压力及安全,防止消毒及表皮意外事件发生。

常用物品消毒压力及时间:

培养液、橡胶制品、10磅10分钟;

布类、玻璃制品、金属器械、18磅20分钟。

上两种是最常见的物理消毒方法。

(3)化学消毒法:最常见的是70%酒精及1‰的新洁而灭,前者主要用于操作者的皮肤,操作台表面及无菌室内的壁面处理。后者则主要用器械的浸泡及皮肤和操作室壁面的擦试消毒。化学消毒法操作简单、方便有效。

(4)抗生素消毒:确切应记成抗生素灭菌,主要用于培养用液灭菌或预防培养物污染。

如果已经发生真菌污染,原则上应尽快丢弃,但是如果是比较珍贵的细胞系,可以用抗真菌药物来尝试抢救,用一般用量的5~10倍来冲击治疗,24~28h后换常规培养液。但是这种方法一般只是在污染早期才有效!

35.二价离子抑制胰蛋白酶活性吗?使用胰蛋白酶时加入EDTA的目的是什么?

二价离子的确抑制胰蛋白酶活性。EDTA用来螯合游离的镁离子和钙离子,以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建议胰蛋白酶处理细胞前,用EDTA清洗细胞,以消除来自培养基中所有的二价离子。

44. 培养基中添加了血清和抗生素后,可长期保存吗?

一旦您在新鲜培养基中添加了血清和抗生素时,您应该在两到三周内使用它。因为一些抗生素和血清中的基本成分在解冻后就开始降解。

45.培养基及其它添加物和试剂可反复冻融吗?

大部分添加物和试剂最多可以冻融3次,如果次数更多都会在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀,将会影响它的性能。

46.为什么要在溶解的一周内使用贮存在4℃冰箱中的液体胰蛋白酶溶液?

胰蛋白酶在4℃就可能开始降解,如果在室温下放置超过30分钟,就会变得不稳定。

47.保存血清最好的方法?

我们建议血清应保存在-5℃至-2O℃。若存放于4℃时,请勿超过一个月。若一次无法用完一瓶,建议无菌分装血清至恰当的灭菌容器内,再放回冷冻。

48. 如何解冻血清才不会使产品质量受损?

将血清从冷冻箱取出后,先置于2~8℃冰箱使之融解,然后在室温下使之全融。但必须注意的是,融解过程中必须规则地摇晃均匀。

49. 血清解冻后发现有絮状沉淀物出现,该如何处理?

血清中沉淀物的出现有许多种原因,但最普遍的原因是由于血清中脂蛋白的变性所造成,而血纤维蛋白(形成凝血的蛋白之一)在血清解冻后,也会存在于血清中,亦是造成沉淀物的原因之一。但这些絮状沉淀物,并不影响血清本身的质量。

若欲去除这些絮状沉淀物,可以将血清分装至无菌离心管内,以400g稍微离心,上清液即可接着加入培养基内一起过滤。最好不使用过滤的方法去除这些絮状沉淀物,因为它可能会阻塞过滤膜。

50. 为什么要热灭活血清?

加热可以灭活补体系统。激活的补体参与溶解细胞事件,刺激平滑肌收缩,细胞和血小板释放组胺,激活淋巴细胞和巨噬细胞。在免疫学研究,培养ES细胞、平滑肌细胞时,推荐使用热灭活血清。

51. 有必要做热灭活吗?

实验显示,经过正确处理的热灭活血清,对大多数的细胞而言是不需要的。经此处理过的血清对细胞的生长只有微小的促进,或完全没有任何作用,甚至通常因为高温处理影响了血清的质量,而造成细胞生长速率的降低。而经过热处理的血清,沉淀物的形成会显著的增多,这些沉淀物在倒置显微镜下观察,像是“小黑点”,常常会让研究者误以为是血清遭受污染,而把血清放在37℃环境中,又会使此沉淀物更增多,使研究者误认为是微生物的分裂扩增。

若非必须,可以不需要做热处理这一步。不但节省时间,更确保血清的质量!

52. 为什么储存在冰箱中的胎牛血清会出现沉淀?

有些胎牛血清产品没有预老化,储存在2-8℃时,血清中的各种蛋白和脂蛋白(如冷凝集素、纤维蛋白原、玻粘连蛋白等)可能聚集而形成沉淀或可见的混浊。这应该不会影响血清的质量。推荐在-20℃储存胎牛血清,避免反复冻融。

53. 如何避免沉淀物的产生?

我们建议您在使用血清的时候,注意下列的操作:

(1)解冻血清时,请按照所建议的逐步解冻法(-20℃至4℃至室温),若血清解冻时改变的温度太大(如-20℃至37℃),非常容易产生沉淀物。

(2)解冻血清时,请随时将之摇晃均匀,使温度及成分均一,减少沉淀的发生。

(3)请勿将血清置于37℃太久。若在37℃放置太久,血清会变得混浊,同时血清中许多较不稳定的成分也会因此受到损害,而影响血清的质量。

(4)血清的热灭活非常容易造成沉淀物的增多,若非必要,可以无须做此步骤。

(5)若必须做血清的热灭活,请遵守56℃,30分钟的原则,并且随时摇晃均匀。温度过高,时间过久或摇晃不均匀,都会造成沉淀物的增多。


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