血清替代品：XerumFree XF205培养基添加物使用说明（二）

实验步骤

A） 用足够的细胞贴壁因子包被细胞培养容器表面。

--一些商用的包被试剂如Pronectin^TM F, MapTRIX^TM或同等的其它产品

--纤连蛋白或多聚赖氨酸或其它

--少量FBS(如对于T25烧瓶添加500ul) 37℃孵育过夜，随后用新鲜培养基或PBS洗两遍。

--利于细胞贴壁的一种即用型塑料器皿。

B）解离细胞成单层细胞

--在无血清条件下使用标准胰蛋白酶可能不太可行，因为血清中含有胰蛋白酶抑制剂。因此为了避免对细胞产生不可逆的损伤，在无血清条件下，最小化残留胰蛋白酶水解活性是非常重要的。为达到最佳效果，可使用胰蛋白酶抑制剂（比如来源于大豆）或用无哺乳动物源的分散剂如Accutase™，且Accutase™在传代过程无需进行失活处理或去除。另外也可以通过洗细胞的方法来去除大部分残留的胰蛋白酶。然而这个方法需要额外的离心步骤，而离心对于某些细胞类型可能有损伤。

--优先选择：不使用胰蛋白酶，使用Accutase™ 或 Detachin™分散细胞为单层细胞；这些细胞分散液已经能够满足温和，有效的分散贴壁细胞的要求；将不会损伤细胞膜和表面表位并且能够保持蛋白表面的结构和功能性能完整。

C）细胞以20000/cm²的密度接种到按照Point 1所制备的完全培养基中。

在从血清培养基到无血清培养基适应过程的第一步中观察高接种密度的状态是重要的。细胞一般可分泌大量调控细胞贴壁、生长和增殖的因子到培养基中。然而，在刚接种时新鲜的无血清培养基中是不含这些因子的，因此为了及时诱导产生足够的自分泌/旁分泌因子，接种时达到细胞密度的临界值是至关重要的。

D）孵育并维持细胞在37℃中培养直至达到80-90%的汇合。

在这个阶段每2-3天换75%培养基。不要丢弃用过的培养基，而把它们收集起来，滤灭并保存于4℃为下一步使用。如果细胞在任何点看起来是停止状态的，那么给更多的时间让细胞去适应新的无血清环境。

E）当接近汇合率时，以1：2或1：3的比例分开细胞。

对于XerumFree^TM的第二个阶段，包被是不需要的，强烈建议使用上一步用过的培养基，因为里面含有调控细胞贴壁，蔓延，生长和增殖的自分泌因子。在含有75%的新鲜无血清培养基+25%用过的培养基（上一步收集起来的）接种细胞。继续每2-3天用75%新鲜培养基更换，以供给细胞，且按照d）步骤继续收集用过的培养基。

F) 重复E）步骤，与之前在含有血清的培养基中的生长情况相比，直到细胞显示出类似生长动态。这个时候可以认为细胞系完全适应了无血清条件培养，这可能需要4-6个阶段。

G) 从这个阶段开始，培养基中可能需要加抗生素。我们建议用广谱性抗生素庆大霉素；与标准的青霉素/链霉素溶液相比，庆大霉素有较低的毒性，庆大霉素建议的使用浓度是：50mg/L。

H）一旦细胞适应无血清培养，就应使用原始的分配比例（在含有血清的培养条件下）。

2.1 细胞系

2.1.2 贴壁非依赖性细胞系

以下操作流程适用于生长在悬浮液中的细胞系。对于贴壁细胞过渡到无血清环境中悬浮生长，请参照TNC BIO’s 技术说明“细胞从单层到无血清环境悬浮培养的适应过程”。

关键成功因素：

抗生素体系的选择

实验步骤

A） 当细胞密度达到3-5×10⁶细胞/ml（依赖于细胞系），开始转换到XerumFree^TM添加的培养基中。收集细胞悬浮液，取出少量进行细胞计数并对整个悬浮液以200g的离心力离心5分钟。

B） 完成细胞计数

C） 在添加XerumFree^TM的培养基中细胞密度为10⁶细胞/ml时，重悬细胞颗粒。

在过渡过程的第一个步骤观察高的细胞接种密度是非常重要的。然而，在接种步骤中，新鲜的无血清培养基中是不含这些因子的，因此为了及时诱导产生足够的自分泌/旁分泌因子，接种时达到细胞密度的临界值是至关重要的。

D） 在37℃中孵育细胞培养物直到细胞密度达到大约3-5×10⁶细胞/ml。

E）通过添加适当体积的新鲜培养基，以1：3或1：4的比例分开悬浮培养物（比如25ml细胞悬浮液+75ml 含有XerumFree^TM的培养基，分到四个单独的培养瓶中）

F）重复E）步骤直到培养物显示出像在原来含有血清的培养基中的生长动态。从那时起，细胞系已经完全适应并可按照含有血清的培养基中的原始比例。

G）从这个阶段开始，培养基中开始加入抗生素。

我们建议使用浓度为50mg/L庆大霉素，与标准的青霉素/链霉素溶液相比，庆大霉素有较低的毒性。

2.2 干细胞

2.2.1 准备步骤—培养器皿表面的包被

如果培养的是人多能干细胞（hPSCs）或多潜能间充质/基质细胞，那么用足够的包被剂处理培养器皿表面是至关重要的，我们一般使用的是制备较粗糙的胞外基质，比如Matrigel^TM。

然而，这些包被剂里含有一些不明确的成分比如小鼠肿瘤源的物质和动物源的成分存在等。

如果需要使用包被剂，我们推荐使用StemAdhre^TM，因其是一个明确的基质，只含有一个由纯粹的人的序列组成的重组蛋白，因此可视为无动物成分（ACF），然而，并不是所有的组织培养板都能用StemAdhre^TM Defined Matrix来包被。

第三种来自Corning 的feeder free，xeno free且化学成分明确的包被剂 Synthemax^TM Surface，这个产品为模仿细胞的天然环境而设计，经过特殊处理、即用型包被塑料器皿，经验证一些hESC和hiPSC细胞系已取得很好的结果。在初始的过渡期转换到Synthemax^TM可能需要注意，但几个阶段后细胞又会恢复良好的生长状态。

在血清替代品的使用说明中不包括Matrigel^TM和StemAdhre^TM的包被操作步骤。